Мулюкіна Н.А. Система санітарного контролю у виноградних розсадниках України

Короткий зміст

Сучасний стан вивчення вірусних, бактеріальних та фітоплазмових хвороб винограду на виробничих виноградниках.  Методи їх діагностики та заходи санітарного контролю у боротьбі з ними

         У вступній та аналітичній частині обґрунтовано актуальність теми, визначено мету і завдання досліджень, показано пріоритетні шляхи розв’язання проблеми.         В огляді використаної літератури проведено аналіз результатів наукових праць вітчизняних і закордонних авторів, які розглядають складові схем санітарного контролю. Наведено дані з вивчення  вірусних, бактеріальних, фітоплазмових та грибних хвороб у виноградарських країнах світу. Проаналізовано особливості методів детекції та ідентифікації збудників цих хвороб за допомогою серологічних і молекулярно-біологічних методів. Представлено результати епідеміологічних досліджень найбільш шкідливих вірусних хвороб і бактеріального раку винограду. Проаналізовано заходи боротьби з вірусними хворобами та бактеріальним раком, які комплексно застосовуються в рамках схем санітарного контролю садивного матеріалу винограду. Зазначено, що в основних виноградарських областях України ще недостатньо досліджені особливості прояву та розповсюдження вірусних хвороб і бактеріального раку протягом останнього десятиріччя та вплив на санітарний стан виробничих виноградників і маточних насаджень безконтрольного ввезення в країну імпортного садивного матеріалу.

Визначено, що в Україні у недостатньому обсязі проведено роботи з дослідження шляхів природного поширення вірусних хвороб і бактеріального раку. Встановлено, що у виноградному розсадництву України немає  науково обґрунтованої єдиної системи санітарного контролю за виробництва садивного матеріалу селекційних категорій. На підставі проведеного аналізу обґрунтовується необхідність вивчення особливостей прояву та поширення вірусних хвороб і бактеріального раку на виробничих виноградниках України в залежності від уражених сортів і регіону проведення досліджень. Визначається актуальність  розробки,  оптимізації та застосування молекулярно-біологічних методів  діагностики латентного ураження збудниками вірусних хвороб та бактеріального раку для одержання вірогідних результатів аналізу.   Обгрунтовується актуальність оцінки санітарного стану маточних насаджень селекційних категорій, закладених у виноградних розсадниках Центру клонової селекції і визначення ризиків їх ураження системними патогенами. Зазначено необхідність науково-методичного обґрунтування і  розробки системи санітарного контролю для виноградних розсадників України.

                       Умови, методи та методики проведення досліджень

         Візуальні спостереження за проявом вірусних хвороб і бактеріального раку винограду здійснювали на виробничих насадженнях   27 прищепних і підщепних  сортів загальною площею близько 817 га та маточних насадженнях 15 прищепних і підщепних сортів категорії „стандартні”  загальною площею 443 га.

Сортимент виробничих виноградників був представлений прищепними сортами Каберне Совіньйон, Піно чорний, Мерло, Одеський чорний, Рубін таїровський, Голубок, Іллічівський ранній, Сапераві північний, Трамінер рожевий, Іршаї Олівер, Аліготе, Шардоне, Рислінг рейнський, Ркацителі, Сухолиманський білий, Біанка, Мускат одеський, Мускат жемчужний, Мускат янтарний,  Королева виноградників, Восторг, Одеський сувенір, Молдова та підщепними – Берландієрі х Ріпарія СО4, Берландієрі х Ріпарія Кобера 5ББ, Ріпарія х Рупестріс 101-14, Феркаль.

Обстежені  маточні насадження категорії «стандартні» знаходилися у п’яти  виноградних розсадниках (Одеська область – ДГ „Таїровске”, ДГ ім. Суворова, ВАТ „Придунайський”, Херсонська область – АФ радгосп „Білозерський” та АР Крим – СВК „Ізумрудний”), виробничі виноградники, що використовувались в якості маточних насаджень – у семи виноградних розсадниках і дев’яти  виноградарських господарствах Одеської, Миколаївської та Херсонської  областей.

         Візуальний санітарний контроль та лабораторне тестування на ураження збудниками вірусних хвороб і бактеріального раку регулярно проводили на двох клонодослідних ділянках і банку клонів  в теплиці ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова». Ці заходи були застосовані також на базових та сертифікованих маточниках 25 клонів 14 прищепних та підщепних сортів винограду загальною площею понад 150 га в п’яти областях України.

         Для росту і розвитку винограду за метеорологічними умовами найбільш сприятливими були 2002 і 2005 роки, а найбільш складними - 1997,  2004 та 2007 роки.

Осінні періоди 2001, 2004 та 2005 років були тривалішими  в порівнянні з багаторічними   даними. Вісім з дванадцяті років дослідження відрізнялися більш теплими осінніми сезонами (в середньому на 1 – 4 °С).

Зимові температури семи з дванадцяти років також були теплішими за багаторічні значення і сприяли добрій перезимовці виноградних кущів, а також  зберіганню грибної інфекції. У 1996, 1997, 2000, 2005 та 2006 роках відмічались різкі коливання температур з короткочасними  значними зниженнями їх значень. Взимку 2005 – 2006 рр. та 2006 – 2007 рр. внаслідок  короткочасного значного зниження зимової температури спостерігалось пошкодження багаторічної деревини, що призвело до збільшення проявів бактеріального раку винограду. Спостерігалась тенденція до зменшення тривалості зим, за виключенням 2003 року.

         Весняні  температури повітря 1996 – 2007 років в цілому були близькі до середніх багаторічних значень, за виключенням помітного перевищення в 2007 році. Весняний період відрізнявся нестійкою погодою, достатнім волого- забезпеченням (за виключенням 2007 року, коли кількість опадів була  майже на 30 % нижчою від середніх багаторічних значень).  Весною 1999 і 2000 років на початку травня відмічались приморозки  до – 3 ˚С.

         За температурним режимом найтеплішими були 1999, 2000, 2001,  2002 та 2007 роки, коли днів з середньодобовою температурою повітря 25 ˚С було в три рази більше норми.

Середньомісячні температури червня були вищими від кліматичної норми в 1999 та 2007 роках, що негативно впливало на виявлення мозаїки жилок та мозаїчних симптомів за ураження коротковузлям винограду. Збільшення середньомісячних температур серпня в 2000, 2001, 2003, 2005, 2006 та 2007 роках позначилося на збільшенні прояву ураження вірусом скручування листя винограду.

         Найбільш вологими були 1997, 2000, 2004 роки, коли за вегетацію опадів випало в 2 рази більше багаторічної норми. Ці роки характеризувалися високими рівнями прояву епіфітотій грибних хвороб, що відображено в даних санітарного контролю  на виноградниках.

         Тривалість періоду з температурою повітря стабільно вище + 10 ˚С в середньому була довше середніх багаторічних. Особливо довгою була активна вегетація в 2004 і 2005 роках.

         Описані вище кліматичні умови позначалися на фізіологічному стані рослин винограду і відповідно впливали на прояв симптомів вірусних, фітоплазмових хвороб, бактеріального раку, хвороб багаторічної деревини грибного походження. Цей вплив позначався також  на концентрації збудників в тканинах  рослин, а отже – певною мірою на результатах виявлення рівнів латентного ураження цими хворобами.

         На виробничих виноградниках та маточниках категорії „стандартні”  візуальне виявлення вірусних хвороб і бактеріального раку винограду проводили шляхом покущового огляду від 5 до 10 відсотків рослин, в залежності від загальної площі насадження. При цьому здійснювали не менше, ніж два проходи по кожній ділянці (клітині), згідно з  «Методическими рекомендациями по агротехническим исследованиям в виноградарстве Украины» (2004).  Загальна кількість рослин, оглянутих на одній ділянці, складала від 500 до 2000 шт.

         Епідеміологічні дослідження проводили візуально на всій площі обраної ділянки. Обліки симптомів коротковузля на зелених частинах виноградного кущу (листя, пагони) проводили в травні – червні, скручування листя – в серпні – вересні, борознистості деревини – в квітні – травні та жовтні – листопаді, мозаїки жилок – в травні – на початку червня.

         Кількість уражених кущів визначали у відсотках від загальної кількості обстежених  кущів.

         Ступінь ураження бактеріальним раком оцінювали за  п’ятибальною шкалою згідно з Лемановою Н.Б. (1989) та «Методическими рекомендациями по агротехническим исследованиям в виноградарстве Украины» (2004).

         Візуальний санітарний контроль проводили на клонодослідних ділянках двох вегетативних поколінь, банку клонів в теплицях ННЦ „Інститут виноградарства і виноробства ім. В.Є. Таїрова”, базових та сертифікованих маточниках в шести виноградних розсадниках п’яти областей України двічі на рік: наприкінці травня – червні та в серпні – вересні в період з 1996 по 2007 рік.

Санітарний контроль проводили шляхом покущового візуального огляду усіх рослин на маточних насадженнях згідно з “Технологією виробництва безвірусного садивного матеріалу” (1989)  та інструкцією з виробництва елітного щепленого садивного матеріалу винограду (1987).

           Імуноферментний аналіз проводили відповідно до метрологічно атестованої методики № МВВ 001-85/3 – 2006 та згідно з інструкцією до діагностичних наборів виробництва фірми “Agritest”(Італія).

         В якості джерела антигену використовували листя та зскрібки кортикального шару визрілої лози.

                   Дволанцюгову РНК винограду виділяли за оригінальним методом Грама                 та Майор (1989) та з нашими попередніми модифікаціями (1992).

         Обробку нуклеазами здійснювали за загальноприйнятою методикою             (1985).

         Горизонтальний електрофорез проводили в 0.7 - 1.5 % гелі агарози за напруги від 100 до 250 В протягом  0.5 – 2 годин.

         Дволанцюгову РНК очищали мікрометодом на целюлозі CF-11 та CF-15 за Dodds et al. (1983)  або препаративним електрофорезом за Маніатіс та ін. (1984).

         Біотинілірування длРНК проводили за допомогою реакції з фотобіотином (1990 р.) за методикою фірми-виробника.

         Гібридизацію імобілізованих на нейлоновому фільтрі екстрактів проводили за методом Маніатіс та ін. (1984).

Колориметричну реакцію здійснювали відповідно  McInnes et al. (1988).

За діагностики   бактеріального раку  бактерії з  тканин винограду виділяли за методом  Лехоцкі (1971).

         Агробактерії виділяли на напівселективному поживному середовищі Рой і Сассера ) (1983). Одержані  на чашках Петрі колонії агробактерій висівали на пробірки зі скошеним  картопляним агаром і витримували 1 добу в термостаті за температури + 28ºС. Культури використовували для ураження рослин-індикаторів.

В якості індикаторів для виявлення збудника бактеріального раку використовували рослини з класу Дводольні, в тому числі каланхоє та диски моркви.

ПЛР проводили відповідно до метрологічно атестованої методики № МВВ 002-85/3 – 2006 та методу, запропонованого Haas et al. (1995).

     Виділення плазмідної ДНК Agrobacterium vitis проводили  з цетавлоном, кип’ятінням або лужним лізісом.

     Для виявлення A. vitis  використовували специфічні праймери virD2 та ipt.

     Ампліфікацію проводили в ампліфікаторі, який забезпечував розбіг температур   від   +4ºС до  100ºС,    в   режимі:     1.  94ºС –  4 хв.;    2.   50ºС –  1 хв,

72ºС – 1 хв, 94ºС – 1 хв (35 циклів); 3. 50ºС – 1 хв., 72ºС – 10 хв. Розчин з продуктами ампліфікації зберігали при -20^ºС.

Електрофорез продуктів ампліфікації ДНК проводили в горизонтальному гелі 4 % агарози в трис-боратному буфері при напрузі 5В/см.

         Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програм „Microsoft Exel” та пакету варіаційної статистики. Використовували методи варіаційної     статистики    (парний   т -крітерій    Стьюдента)     та     кореляційний

аналіз. Визначення випадковості співвідношення результатів, одержаних вихідними та модифікованими методами діагностики, проводили згідно Літтл Т. та Хіллз Ф. (1981).