ОСНОВНІ ФАРМАКОЛОГІЧНІ ЕФЕКТИ КУМАРИНВМІСНОГО ЗАСОБУ – ВОДНОГО ЕКСТРАКТУ З ТРАВИ БУРКУНУ

Короткий зміст

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили в лабораторії фармакології і тканинної терапії (ІОХіТТ) ім. В.П. Філатова АМН України, яка   сертифікована ДФЦ МОЗ України (посвідчення № 31 від 2006 р.) у повній відповідності з вимогами Комісії з біоетики ІОХіТТ (протокол № 8   від 7.11.2006 р.) та Методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Київ, 2001).

Роботу виконано на 159 кролях породи Шиншила масою 1,8– 6,0 кг (різного віку), 120 білих щурах лінії Wistar масою 180–220 г, 94 нелінійних білих мишах масою 20–22 г, 35 жабах,  вирощених у розплідниках віваріїв Одеського державного медичного університету та ІОХіТТ. Всі тварини були статевозрілі, обох статей, знаходились в умовах віварію ІОХіТТ на стандартному раціоні за встановленими нормами.

Водний екстракт буркуну для ін'єкцій  виготовлено з трави  буркуну лікарського в лабораторії фармакології і тканинної терапії ІОХіТТ за методом академіка В.П. Філатова, технологію запатентовано (Патент України на корисну модель № 3544 „Спосіб одержання водного екстракту буркуну” від 15.11.04 р.).

В якості референтного препарату використовували  тканинний препарат ФіБС, який відноситься до фармакотерапевтичної групи біогенних стимуляторів, що регулюють метаболичні процеси  (М.Д. Машковский, 2005).       Визначення в екстракті буркуну кумарину і двох оксікумаринів (скополетин, умбеліферон)  проводилося після екстракції їх із препарату хлороформом з наступною  хроматографією на  пластинках Сорбфіл у суміші розчинників циклогексан Р – ацетон Р – 2–пропанол Р (20:4:1). Наявність кумаринів встановлювалася в УФ світлі при довжині хвилі  366 нм після обробки лужним розчином (ДФУ, 2001). Кількісне визначення суми кумаринів і дослідження спектрів поглинання проводилося на спектрофотометрі СФ–46 у кюветі з товщиною шару 1 см при довжинах хвиль 240–360 нм.

 Гостру та субхронічну токсичність вивчали на 3-х видах лабораторних тварин (миші, щури, кролі) згідно Методичним рекомендаціям ДФЦ України (2001). Використовувалися дози з урахуванням максимально припустимих фізичних обсягів введення рідин (К.К. Сидоров, 1973). Для патоморфологічних досліджень  тканини міокарда, легень, печінки, нирок  були фіксовані в 10 % розчині нейтрального формаліну, піддавалися спиртовій проводці, заливці в  парафін. Оглядові препарати фарбувалися гематоксилін-еозином (Г.А. Меркулов, 1969). Ультратонкі зрізи тканини печінки  фарбували розчинами уранілацетату і цитрату свинцю. Переглядали і фотографували зразки в електронному мікроскопі ПЭМ–100.

Експериментальні дослідження  рівня біологічної активності  екстракту буркуну на скринінгових біотестах (дріжджовому, парабіотичному, стрихніновому, антигіпоксичному) виконані відповідно Методичним рекомендаціям ДФЦ України (2001).

         Вплив екстракту буркуну і ФіБСу на детоксикуючу функцію печінки оцінювали на моделі  гексеналового сну у кролів. Гексенал вводили внутрішньовенно в дозі 35 мг/кг маси у вигляді 5 % водного розчину. Тривалість сну в контрольній групі приймали за 100 %.

Гепатозахисну дію екстракту буркуну і ФіБСу вивчали в умовах токсичного ураження печінки тетрахлорметаном (CCl₄), який вводили внутрішньошлунково у вигляді 50 % олійного розчину з розрахунку 0,5 мл на 100 г маси тіла  протягом двох днів (Ю.И. Губский, 1989).

Для оцінки профілактично-лікувальної дії екстракту буркуну і ФіБСу на хід експериментального токсичного ураження печінки  вивчали активність маркерних ферментів цитолізу: аланінамінотрансферази (АлАТ),  аспартатамінотрансферази (АсАТ) – за Райтман і Френкель у модифікації  В.Г. Колб і В.С. Камишніков (1986), кількість загального білка в сироватці крові – біуретовим методом  (А.М. Горячковский, 1998).  Антиоксидантну дію препаратів  визначали за вмістом дієнових кон’югатів  (ДК) (В.А. Костюк та ін., 1984) і малонового діальдегіда  (МДА) у сироватці крові   (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977).

Антитоксичні  та мембраностабілізуючі властивості екстракту буркуну вивчали у кролів різного віку, масою від 3,6–6,0 кг,  при 30-денному курсовому введенні. Для оцінки антитоксичної функції печінки використовували бромсульфалеїнову пробу за методикою В.В. Меньшикова (1971), осмотичну  за М.А. Базарновою (1982) і перекисну резистентність еритроцитів  (М. Mino, 1978). Визначали вміст водо- і жиророзчинних антиоксидантів в крові (J. Glavind, 1963) і  активність каталази (М.А. Королюк та ін., 1988)  в плазмі крові та печінці.

 Вивчення антиагрегаційної активності  екстракту буркуну і ФіБСу проведено в дослідах in vitro за методом Борна на багатій тромбоцитами плазмі крові людини на агрегометрі  THROMLITE – 1006 А («Биохиммак», Росія) на базі Фізико-хімічного інституту ім. А.В. Богатського НАН України. Виражаємо щиру вдячність проф. Карасьовій Т.Л. за надання консультативно-методичної допомоги при виконанні досліду. Суть методу полягає в перевірці здатності досліджуваних об'єктів інгібувати АДФ – викликану агрегацію  тромбоцитів крові після їхньої попередньої інкубації з плазмою крові людини (G.V. Bo , 1962). Об'єктами даної перевірки були 3 серії екстракту буркуну  – лабораторні зразки і препарат порівняння біогенний стимулятор ФіБС  з урахуванням розведення в кюветі агрегометра в 7 разів. Антиагрегаційна активність наведена у відсотках інгібування (I %) агрегації тромбоцитів у порівнянні з контролем.

Вивчення впливу екстракту буркуну і  ФіБСу на коагуляційний гемостаз при курсовому введенні було  проведено на  51 кролі породи Шиншила, масою 3,0– 4,7 кг, розподілених на 9 піддослідних  груп: 3 контрольних (по 5 кролів) і 6 піддослідних (по 5–7 кролів). Показники  гемостазу у тварин вивчали до початку досліду (вихідний рівень),  на 7, 14, 21 дні введення, через 1 і 2 тижні після  закінчення курсу.  Екстракт буркуну і ФіБС вводили тваринам підшкірно в  дозах:  0,3; 1,0 і 3,0 мл/кг для кожної піддослідної групи, відповідно. Контрольним тваринам вводився фізіологічний розчин в аналогічних об’ємах. Визначали наступні показники коагулограми: тромбіновий, протромбіновий, активований парціальний тромбопластиновий час і вміст фібриногену оптичним методом на турбідиметрічному гемокоагулометрі фірми "Солар" (Мінськ) з використанням реактивів фірми "НПО Ренам" (Москва) згідно стандартним  методикам (З.С. Баркаган, А.П. Момот, 2001) з урахуванням методичних рекомендацій  до   приладу  (В.В. Дмитриев, 1997). Хагеман-залежний фібриноліз визначали за Kowalski, Kopec, час лізису еуглобулінового зсідка за Kowarzyk, Buluk             (З.С. Баркаган, А.П. Момот, 2001) та показник фібринолітичної активності згідно методичним рекомендаціям  (Ю.О. Киселевский  и др., 1997).

Вплив екстракту буркуну на перебіг експериментальної гіфеми – крововиливу у передню камеру ока (Г.В. Самсонов та ін., 1985) проводили на кролях породи Шиншила, статевозрілих, масою 3,6–5 кг. Усього використано 15 кролів (30 очей), розподілених нарівно на 3 групи: 1 група – контрольна патологія (без лікування); 2 і 3  групи – модель гіфеми з наступним введенням екстракту підкон’юнктивально і підшкірно, відповідно. Екстракт буркуну вводився через 4 години після створення гіфеми в дозі   0,3 мл/кг протягом 10 днів.

 Оцінку коагуляційної і фібринолітичної активності слізної рідини проводили за Е.Г. Сомовим, В.В. Бржеским (1992). Внутрішньоочний тиск  вимірювали за допомогою тонометра Маклакова масою 7,5 г у ті  ж терміни.

Статистичну обробку даних проводили з використанням методів параметричної і непараметричної статистики  за допомогою програми ”Microsoft Excel для Windows – 2000, Statistica 5.5 (С. Гланс, 1999).

Результати досліджень та їх обговорення. Наявність кумарину  виявляли шляхом зіставлення  на хроматограмах зон випробуваного розчину і свідка – синтетичного кумарину. При цьому кумарин виявляється у вигляді зони, що флуоресцирує зеленувато-жовтим кольором. Наявність оксикумаринів підтверджено зіставленням хроматограм випробуваного розчину з достовірними речовинами-свідками – скополетином і умбеліфероном, що подані таким чином: умбеліферон – зона, що флуоресцирує яскраво-блакитним кольором (у середній частині хроматограми),  скополетин – зона, що флуоресцирує блакитним кольором (у нижній частині хроматограми).

Спектри поглинання випробуваних розчинів  мають виражений максимум, що однозначно дозволяє проводити  кількісне визначення кумаринів при довжині хвилі поглинання кумарину, яка дорівнює  272 нм. На підставі  фактичних даних встановлено, що вміст суми кумаринів  у  екстракті буркуну (у перерахунку на кумарин)  складає не менше 0,09 %.

Дані, отримані при вивченні гострої токсичності, дозволяють віднести екстракт буркуну до практично нетоксичних  препаратів (LD₅₀>50 мл/кг) за класифікацією К.К. Сидорова (1973).

Тривале введення на протязі 30 днів у дозах 0,3  і 1,0 мл  не сприяє будь якому токсичному впливу на організм різних видів піддослідних тварин. Це підтверджується біохімічними показниками крові та відсутністю деструктивно-дистрофічних змін у тканинах внутрішніх органів  кролів  при гістоморфологічних дослідженнях.     Вивчення ультраструктури гепатоцитів проводилось після 21-денного введення екстракту буркуну і   ФіБСу  у дозі 0,3 мл/кг. Слід зазначити –  в гепатоцитах кролів, що отримували екстракт виявлено накопичення кількості рибосом, полісом, мітохондрій, зернистої ендоплазматичної сітки, глікогену, що свідчить   про посилення   білоксинтезуючої, енергообразуючої   функцій печінки, що в цілому відображає активацію  метаболічної діяльності, спрямованої на збільшення в клітинах пластичного матеріалу. Підвищення клітинної резистентності під впливом екстракту буркуну  є одним з істотних компонентів посилення загальної резистентності організму.

Доклінічна фармакологічна оцінка лікарських засобів з натуральної сировини, призначенних для стимуляції неспецифічної резистентності та адаптаційних можливостей організму, має свої особливості. Це пов’язано, в першу чергу, з наявністю у препаратах названої групи складних комплексів біологічно активних сполук з широким спектром фармакологічної дії. Тому вивчення рівня їх біологічної активності проводять на спеціальних тестах. На дріжджовому тесті встановлено,  що екстракт буркуну  володіє високою стимулюючою активністю. Три серії  виявляють практично однаковий вірогідно виражений ефект (1050–1100 %). Необхідно відзначити, що рівень біологічної активності   ФіБСу  складає 110–120 %. Таким чином, у порівнянні з ним  рівень  біологічної активності екстракту буркуну  у  9 разів вище.

На парабіотичному тесті  перевірені три серії екстракту буркуну у наступних концентраціях: нативний препарат (per se), 0,1  і 0,01 %  розчин. Найбільш високі результати були отримані при перевірці 0,1 % розчину: активність  у даній концентрації перевищувала контрольні показники, у середньому, на 48,7 %.

На стрихніновому тесті встановлено,  що попереднє введення екстракту буркуну у дозах 0,2; 0,3 і 0,5 мл  викликає достовірне збільшення тривалості життя мишей на 86,9;  27,3 і  36,3 %, відповідно. Крім того, на фоні 100 % загибелі контрольних тварин при введенні стрихніну вижило 11; 11 і 22 % тварин, відповідно (р<0,05).

 На фоні розвитку гострої гістотоксичної гіпоксії встановлено, що попереднє однократне  введення екстракту буркуну у дозі 0,5 мл вірогідно подовжує тривалість життя мишей на 36 % у порівнянні з контролем.

Екстракт буркуну зменшує тривалість гексеналового сну на 20 % у порівнянні з контролем, що свідчить про посилення детоксикуючої функції печінки за рахунок активації мікросомальних ферментів гепатоцитів, метаболізуючих гексенал.  

Вивчення гепатозахисних властивостей екстракту буркуну та ФіБСу  проводили на моделі токсичного ураження печінки тетрахлорметаном (CCl₄), генез якого пов’язаний з індукцією вільнорадикального окислення ліпідів.

Гостре отруєння  ССl₄ характеризувалося значними змінами усіх досліджуваних показників. В групі контрольної патології спостерігалося збільшення масового коефіцієнту печінки, зменшення загального білка, зростання активності трансаміназ у групі контрольної патології  АлАТ– на   112,8 % і АсАТ– на 131,9 %, підвищення в сироватці крові проміжних (ДК) і кінцевих (МДА) продуктів окислення ліпідів у 4,3 і 6,7 рази.

Профілактично-лікувальне введення екстракту буркуну сприяло зменшенню коефіцієнта маси печінки та нормалізації загального білка практично до показників інтактних тварин.  В групі, яка отримувала ФіБС,  коефіцієнт маси печінки був  на  25 %  вищим (р<0,05).