\"СТРУКТУРНІ, УЛЬТРАСТРУКТУРНІ, ІМУНОГІСТОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ЕНДОМЕТРІЯ СЕКРЕТОРНОЇ ФАЗИ МЕНСТРУАЛЬНОГО ЦИКЛУ ПРИ НЕПЛІДНОСТІ.”

Короткий зміст

Матеріали та методи дослідження. Нами було вивчено 100 біопсійних зразків ендометрія секреторної фази менструального циклу від жінок з неплідністю нез’ясованого та запального генезу та жінок- донорів ооцитів. Досліджуваний матеріал було розподілено на 3 групи: I група - ендометрій секреторної фази менструального циклу   жінок – донорів ооцитів (20 зразків); II група – ендометрій секреторної фази менструального циклу  жінок з неплідністю нез’ясованого генезу (40 зразків); III група – ендометрій секреторної фази менструального циклу  жінок з неплідністю запального генезу (40 зразків).

            Всім пацієнткам  морфологічне дослідження ендометрія проводилося два рази:  на 19-20 та 21-22 дні м/ц. Забір матеріалу здійснювався ендометріальним семплером  Пайпель де Корн'є (фірма C.C.D. Inte ational, Франція).

            Для вирішення поставлених завдань у дослідженні були використані наступні методи: загальногістологічні, електронномікроскопічний (скануюча електронна мікроскопія), імуногістохімічний.

   Загальногістологічний - проводили за стандартною схемою. Відразу після забору частину біопсійного матеріалу фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну, зневоднювали у спиртах та заливали у парафінові блоки. Фарбування зрізів проводилось гематоксиліном та еозином, а також - за Ван Гізон. Мікроскопічні дослідження здійснювали за допомогою світлооптичного мікроскопу  Olympus CX31 (фірма Olympus, Японія)

   Для дослідження ендометрія методом скануючої електронної мікроскопії матеріал відмивався від крові у фізіологічному розчині та фіксувався у 1,25% розчині глутарового альдегіда на 0,1 М фосфатному буфері (рН 7,4) та дегідратувався розчином ацетону на дистильованій воді у зростаючих концентраціях (від 60 до 100%) – по 10 хвилин в кожній порції. В 100% ацетоні матеріал до наступного етапу зберігався в морозильній камері при температурі- 20є С.  Висушування проводилось за допомогою методу переходу критичної точки. Далі з метою виключення накопичування зарядів та отримання достатньо контрастної картини на поверхню зразків напиляли золото (150-200 А). Скануюча електронна мікроскопія виконувалась на мікроскопі з рентгенівською приставкою „ JEOL Superprobe 733” зі збільшенням х 2000.

  Імуногістохімічний метод: непрямий стрептавідин - пероксидазний метод виявлення експресії рецепторів до естрогенів (клон 1D5, DАКО) й прогестерону (клон 1А6, DАКО) із нанесенням АЕС та подальшою інкубацією до появи червоно – коричневого забарвлення та наступним дофарбовуванням гематоксиліном Майєра.

   Розповсюдженість та інтенсивність імуногістохімічної реакції оцінювали напівкількісним методом в балах - від 0 до 3. Розповсюдженість : 0 – немає забарвлення; 1 – менше 10% позитивно забарвлених клітин; 2 – більше 10% і менше 50% позитивно забарвлених клітин; 3- гомогенне забарвлення більше 50% клітин. Інтенсивність реакції: 0 балів – немає видимого забарвлення; 1 бал – слабке забарвлення; 2 бали – помірне забарвлення; 3 бали – виразне забарвлення.

            Отримані в результаті досліджень дані обробляли методом варіаційної статистики з використанням статистичних програм для персонального комп’ютера IBM PC/AT (Statistica for Windows 5,0; MS Excel 7). Для твердження про вірогідність відмінностей використовували загальноприйняту в медико-біологічних дослідженнях величину рівня вірогідності  р≤0,05.

            Результати дослідження і їх обговорення. В результаті проведеного комплексного гістологічного, електронномікроскопічного, імуногістохімічного  аналізу досліджень встановлено, що морфологічними критеріями повноцінного розвитку ендометрія середньої стадії  секреторної фази жінок І групи є  ознаки секреторної трансформації в структурах поверхневого епітелія, залоз, строми. На 19 день м/ц залози більш звивистої конфігурації, місцями нерівномірно розширені, діаметр їх збільшений в порівнянні із попередніми днями. Епітелій, що вистеляє просвіт залозистих структур - одношаровий циліндричний, в усіх відділах цитоплазми виявляються дрібні вакуолі, верхівка клітин  представлена апікальними пухирцями різних розмірів. Ядра епітеліальних клітин круглі, світлі. Строма багатоклітинна, представлена округлими, овоїдної форми клітинами. Судини функціонального шару ендометрія в цей термін спостерігаються тонкостінні, нерівномірно розташовані, клубків спіралеподібних артеріол не виявлено, лімфоїдні клітини в стромі не виявляються.

       На 20 день циклу  співвідношення залози до строми в функціональному шарі  змінюється і дорівнює більше ніж 1:1. Залози мають просту трубчасту структуру з широким просвітом. Клітини, які їх вистеляють, низькі циліндричні з базально розташованим ядром, великими ядерцями та гранулярною або вакуолізованою цитоплазмою, апікальні відділи якої пухирчасті, як наслідок апокринової секреції клітини.В просвітах  залоз міститься гранулярний, еозинофільний секрет. В стромі ендометрія спостерігається незначний набряк.

       На 21 день ще виявляється секрет у просвіті залоз, які представляють собою  розширені трубчасті структури, набряк строми помірний. Співвідношення залоз до строми  зменшується і дорівнює 1:1. Клітини строми дрібні з вузьким обідком цитоплазми.  Яскраво виражена васкуляризація строми ендометрія з наявністю прямих артерій та капілярів з явищами   вазодилятації. Популяція лімфоїдних клітин в стромі стає більш виразною та характери-зується появою ізольованих лімфоцитів чи їх невеликих агрегатів.

       На 22 день циклу  набряк строми  - максимальний, що сприяє зміні співвідношення залози-строма, воно стає менше ніж 1:1. Залози з розширеним просвітом, заповнені секретом. Епітелій, що їх вистеляє, низький циліндричний з базально розташованим ядром, непомітними ядерцями та гранулярною цитоплазмою. Клітини строми дрібні, овальні. Мітози відсутні як в  клітинах залоз, так і  в стромальних клітинах. Зростання спіральних артерій ще не виявляється. Лімфоїдні клітини стають багаточисельними, виразність їх підкреслюється набряком строми. В 10%  випадків спостерігалися початкові явища периваскулярної предецидуальної реакції строми ендометрія: сполучнотканинні клітини компактного шару навколо судин збільшені за розмірами,  округлої або полігональної форми, в цитоплазмі їх виявляється глікоген.

Імуногістохімічними критеріями нормального розвитку ендометрія були: слабка (1 бал) експресія ЕР в ядрах клітин залоз та строми  з низькою  розповсюдженістю (до 10%), виразна експресія ПР (2-3 бали) в ядрах клітин строми  та слабка (1 бал) в ядрах клітин епітелія залоз.

 На ультраструктурному рівні із застосуванням скануючої електронної мікроскопії своєчасний розвиток ендометрія характеризується наступними ознаками: спостерігається стадійність формування та розвитку піноподій, наявність  повністю сформованих піноподіальних структур на 19-22 день м/ц, які займають більш ніж 50% площі досліджуваної поверхні та характеризуються як рясні

Таким чином, зміни, що відмічалися нами в більшості досліджень цієї групи  співпадали з даними світової літератури [ Noyes R.,1950; Nicas G.,2002; Robboy S.J.,2002; Zaino R.,2003 ].

Проведений комплекс загальногістологічних, електронномікроскопічних, імуногістохімічних досліджень особливостей ендометрія жінок з неплідністю нез’ясованого ґенезу виявив, що в 55 %  випадків спостерігалась невідповідність розвитку ендометрія хронологічному дню м/ц, а саме - відставання у дозріванні, в порівнянні з жінками І групи. Залозисті структури були при цьому з ознаками відставання від хронологічного дня менструального циклу,  мали нерівномірний діаметр та менш звивисту конфігурацію, епітеліальні клітини їх циліндричного типу з поодинокими мітозами,  наявністю вакуолів. Ознаки повноцінної інтралюмінальної секреції не спостерігались, однак поодинокі залози ендометрія містили секрет. В стромі ендометрія при цьому спостерігалось зниження  інтенсивності або відсутність набряку. Клубки спіралеподібних артерій ендометрія, в порівнянні з І групою, не були чітко окресленими, явища предецідуальної реакції  не спостерігались.

В 15% досліджень цієї групи відмічалась наявність гіпотрофічного ендометрія, в якому спостерігалась зменшена кількість залоз невеликого діаметру , не звитих, без ознак секреторної активності. Мітози в епітеліальних клітинах залоз не спостерігались Строма ендометрія при цьому була неоднорідна: вогнища  фіброзу, ділянки нерівномірного набряку, клітини її мали веретеноподібну, подовжену форму.

В 10% біопсійних зразків ІІ групи спостерігалась проста гіперплазія ендометрія:  зі збільшеною кількістю залоз, добре розвинутою та гіперплазованою цитогенною стромою. Залози при цьому різноманітні за кількістю та формою, частина їх кістоподібно трансформована. Вистілка залозистих структур представлена високим циліндричним епітелієм з чітко окресленим апікальним краєм клітин, багаторядово розташованими  овальними або дещо витягнутими, багатими на хроматин ядрами, базофільною цито-плазмою; також зустрічались клітини, що мали світлу прозору цитоплазму. Стромальні клітини дещо збільшені в об’ємі з ацидофільною цитоплазмою. Спостерігалась підвищена мітотична активність в клітинах залоз і строми в порівнянні з І групою.

 В 20% випадків на гістологічному рівні спостерігалась наявність ендометрія, що відповідає хронологічному дню менструального циклу , без патологічних змін в залозах та стромальних структурах : поверхневий епітелій циліндричного типу, його клітини  з поодинокими вакуолями. Залози  простої трубчастої структури  з широким просвітом (100 мкм та більше); епітеліальні клітини, які їх вкривають, низькі циліндричні з базально розташованим світлим ядром та гранулярною або вакуолізованою цитоплазмою, а апікальні відділи цитоплазми пухирчасті. Спостерігається виразний набряк строми  з харак-терною його нерівномірністю  майже  у всіх випадках , дрібними клітинами строми  зі зменшеною кількістю цитоплазми. Мітози в ядрах стромальних клітин виявляються в цей період поодинокі. Популяція лімфоїдних клітин виразна та характеризується наявністю ізольованих лімфоцитів чи їх невеликих скупчень. Спіралеподібні артеріоли виразно визначаються як в глибоких, так і в поверхневих відділах функціонального шару, їх поширена спіралізація призводить до появи множинних кластерів маленьких артеріол .

Імуноідентифікація РЕ в ендометрії ІІ групи показала достовірне (р< 0,05) підвищення інтенсивності експресії в ядрах клітин залоз та строми (2-3 бали) в порівнянні з І групою. Не у всіх випадках різко зменшується експресія РЕ після овуляції. У деяких цей процес не відбувається взагалі, або відбувається пізніше, тим самим призводячи до відставання розвитку ендометрія й ембріо-ендометріальної асинхронії. В 30% випадків спостерігалося нерівномірне, вогнищеве розташування РЕ. Експресія РП в ядрах клітин залоз в цій групі достовірно більша ніж в І групі (р< 0,05) і сягає 2 балів. Експресія РП в ядрах клітин строми дорівнює 1-2 балам . Ці показники  дещо нижчі, але різниця з I групою не досягає статистично достовірного рівня. У більшості випадків спостерігається затримка зниження експресії одного (РП в залозах) або двох (РЕ в залозах і стромі та РП в залозах) рецепторів. Це може пояснювати запізнення розвитку потрібних процесів рецептивності в ендометрії та, як слідство,  призводити до порушення імплантації.

 Ці зміни можна пояснити дисхронозом розвитку ендометрія, що перешкоджає імплантації бластоцисти та є важливими для відновлення рівноваги між розвитком бластоцисти та дозрівання ендометрія.

Скануюча електронна мікроскопія показала, що в ендометріальних зразках жінок ІІ групи нормальний, своєчасний розвиток піноподій в поверхневому епітелії спостерігався в 20% випадків, але за поширеністю по поверхні вони характеризувались як нечисельні (займали менш ніж 20% площі). У 80% випадків нами було виявлено патологію формування та розвитку піноподій: зупинка розвитку (піноподії в однаковому стані початкового розвитку спостерігалася в обох біопсійних зразках ) відмічалась в 10% біопсійних зразків; затримка розвитку піноподій спостерігалась в 50%: з них в 30 % випадків було виявлено відставання, а ще в 20% зразків -  піноподіальні структури були відсутні на будь-якій зі стадій свого розвитку в обох біопсійних зразках; ще в 20% біопсій відмічалась наявність дисхронозу розвитку досліджуваних структур, що вказує на  відсутність повноцінного розвитку ендометрія, наявності ембріо-ендометріальної асинхронії  та призводить до порушення імплантації бластоцисти.

Таким чином, в ІІ групі дослідження у жінок з неплідністю нез’ясованого ґенезу спостерігалися наступні морфологічні критерії пошкодження ендометрія: відставання розвитку ендометрія від хронологічного дня менструального циклу, гіпотрофія ендометрія , проста залозиста гіперплазія. 

На імуногістохімічному рівні спостерігалось порушення експресії РЕ  в ядрах клітин залоз та строми від виразної  вогнищевої  до нерівномірної слабкої. Експресія ПР в ядрах клітин залоз та строми  також характеризувалась як порушена, особливо в ядрах клітин залоз.

На ультраструктурному рівні були виявлені порушення кількості піноподій:  нормальний розвиток ютеродомів, але зменшена кількість та вогнищеве розташування, порушення динаміки росту піноподій та часу їх виникнення: затримка розвитку (50%),  зупинка розвитку (10%) та дисхроноз (20%).

Проведений комплекс загальногістологічних, електронномікроскопічних, імуногістохімічних досліджень особливостей ендометрія секреторної фази менструального циклу жінок з неплідністю запального ґенезу (ІІІ група) виявив наявність  хронічного ендометриту в 40% випадків,  відставання розвитку ендометрія в 20%, наявність простої  гіперплазії ендометрія  та залозисті поліпи ендометрія (по 10 % відповідно),  в 15 % відмічалась гіпотрофія ендометрія,  відповідність розвитку дню м/ц було виявлено в 5% зразків.  

При цьому в 40%  випадків хронічного ендометриту,  крім виразної лімфоцитарної інфільтрації було виявлено плазмоцити, що є важливою діагностичною ознакою «хронічного ендометриту», так як на відміну від лімфоцитів вони не були присутні в  ендометрії жінок І групи. Плазмоцити в стромі ендометрія, в основному,  мали ексцентрично розташоване ядро, бліду перинуклеарну зону й були найбільш численними в перигландулярному просторі, субепітеліальній стромі та навкруги лімфоїдних агрегатів. Діаметр залозистих структур був нерівномірний, залози мали менш звиту конфігурацію у порівнянні з І групою , епітеліальні клітини залоз циліндричного типу з  рясною, еозинофільною цитоплазмою, збільшеним ядром та наявністю численних вакуолів. Ознаки інтралюмінальної секреції  невиразні  або  виявлені в поодиноких залозах. В стромі ендометрія спостерігалось зниження інтенсивності набряку майже до повної його відсутності, наявність вогнищ фіброзу. Клітини строми мали веретеноподібну форму, були біполярними в порівнянні з округлими, овоїдними  клітинами строми ендометрія в І групі.  

В 15% випадків гіпотрофії ендометрія  відмічалось зменшення кількості залоз та їх діаметру , в яких не було ознак секреторної активності. Мітози в епітеліальних клітинах залоз не спостерігались або в окремих залозах відмічались поодинокі. Строма при цьому була неоднорідна з   вогнищевим  фіброзом,  нерівномірним набряком  та інфільтрована  поодинокими лімфоцитами.

Залозисті поліпи ендометрія було виявлено в 10% випадків. Залози в поліпах розташовувались нерівномірно, невпорядковано, мали різну форму та розмір, строма  - з явищами дифузного нерівномірного фіброзу, вогнищами скупчення лімфоцитів, поодиноких плазмоцитів. Просвіт частини залоз був вузьким, інших - розширеним і, навіть, кістоподібно розширеним, деякі залози мали пилкоподібну звивисту форму. Залозисті структури вислані високим циліндричним епітелієм проліферативного типу, а в кістоподібних залозах епітелій мав сплощену форму. Фіброваскулярне ядро поліпів містило фіброзні та гладком’язеві волокна, залози розташовані невпорядковано та витягнуті відповідно до форми ніжки поліпів,  кровоносні судини в ніжці поліпів мали склерозовані, потовщені стінки, а в основі поліпів  утворювали клубки.

В 10% спостережень нами було виявлено просту гіперплазію ендометрія, коли ендометрій був зі  збільшеною кількістю нерівномірно розташованих залоз,  добре розвинутою та гіперплазованою цитогенною стромою. Залози різноманітні за кількістю та формою, частина їх кістоподібно трансформована. Вистілка залозистих структур представлена високим циліндричним епітелієм з багаторядово розташованими ядрами та чітко окресленим апікальним краєм клітин. Ядра овальні або дещо витягнуті, багаті на хроматин, без ознак атипії. Цитоплазма  епітеліальних клітин  базофільна, але зустрічались клітини, які мали світлу прозору цитоплазму. Стромальні клітини дещо збільшені в об’ємі, цитоплазма їх ацидофільна. В клітинах залоз і строми відмічалась помірна мітотична активність.

В 20% випадків спостерігалась невідповідність розвитку ендометрія хронологічному дню м/ц - відставання у дозріванні, в порівнянні з жінками І групи. Залозисті структури  при цьому мали нерівномірний діаметр та менш звивисту конфігурацію, епітеліальні клітини їх циліндричного типу з наявністю вакуолів. Ознаки повноцінної інтралюмінальної секреції не спостерігались. В стромі ендометрія при цьому спостерігалось зниження  інтенсивності або відсутність набряку в порівнянні з І групою.

В 5% випадків на гістологічному рівні спостерігалась наявність ендометрія, що відповідає хронологічному дню менструального циклу , без патологічних змін в залозах та стромальних структурах .

 Імуноідентифікація  РЕ в середню лютеїнову фазу м/ц в ендометрії жінок ІІІ групи дослідження показала наявність експресії з інтенсивністю  в 1 бал та  нерівномірної  розповсюдженості та в 2 бали – вогнищево в ядрах клітин залоз. Експресія РП в ядрах епітеліальних клітин  та ядрах клітин строми  була слабкопозитивною, а іноді не спостерігалась, відмічалось достовірне (р< 0,05) зниження експресії РП в ядрах клітин строми ендометрія .

            Скануюча електронна мікроскопія показала, що нормальний розвиток піноподій спостерігався  в 30 % випадків, але піноподії при цьому були поодинокі або розташовувались вогнищево та поєднувався із наявністю циліарних клітин, які були збільшені в кількості й розподілялись нерівномірно, вогнищево; зупинка розвитку (піноподії в однаковому стані початкового розвитку спостерігалися в обох біопсійних зразках )- в 40 % випадків; дисхроноз розвитку з наявністю піноподіальних структур на різних стадіях свого розвитку  було виявлено в 30% біопсійних зразків.

            Після проведеного загальногістологічного дослідження  у жінок з неплідністю запального генезу  встановлено критерії пошкодження тканини ендометрія: лімфо-плазмоцитарна інфільтрація строми, нерівномірний діаметр залоз, наявність   вакуолів в епітеліальних клітинах залоз , незначні ознаки інтралюмінальної секреції, зниження інтенсивності набряку строми майже до його відсутності,  виразний нерівномірний фіброз строми; залозисті поліпи, гіперплазія та гіпотрофія ендометрія, відставання розвитку від дня м/ц.

             При імуногістохімічному дослідженні виявлено порушення рецепторної активності ендометрія у вигляді вогнищевої, нерівномірної експресії РЕ  та слабовиразної експресії РП в ядрах клітин залоз та строми.

            На ультраструктурному рівні у пацієнток цієї групи дослідження спостерігалось вагоме порушення  кількості циліарних клітин ( збільшена кількість із гіпертрофією війок або відсутність) на тлі патології формування піноподій.

            Таким чином, в ІІІ групі нами було виявлено  критерії порушення рецептивності ендометрія при наявності трубно - перитонеальної форми неплідності, які відіграють значну роль у формуванні невдач імплантації    у жінок, які проходять лікування методом екстракорпорального запліднення із наступним переносом ембріона в порожнину матки і є важливими для діагностики та попередження  виникнення цієї патології.

ВИСНОВКИ

            1. У дисертації вирішене актуальне наукове завдання по вивченню структурних, імуногістохімічних та ультраструктурних особливостей ендометрія секреторної фази менструального циклу при неплідності. Встановлено основні морфологічні зміни в структурах ендометрія при різних формах неплідності. Розроблено критерії рецептивності ендометрія, що базувались на визначенні зміни рівня  експресії рецепторів до естрогенів та прогестерону, порушення формування й дозрівання піноподій та циліарних клітин поверхневого епітелія ендометрія.     

2. Встановлено, що у жінок з неплідністю нез'ясованого  та запального генезу   спостерігається достовірне  порушення дозрівання ендометріальних структур та зміни  " імплантаційного вікна "  на різних рівнях: гістологічному, імуногістохімічному, електронномікроскопічному.

3.   В порівняльному аспекті в групі жінок з неплідністю нез'ясованого ґенезу (ІІ група)  спостерігається  переважання патологічних змін  над ендометрієм, розвиток якого відповідає дню м/ц, у вигляді: відставання розвитку ендометрія від хронологічного дня менструального циклу  (55%) , гіпотрофії ендометрія (15%), простої гіперплазії ендометрія (10%)  на відміну від  групи жінок з неплідністю запального ґенезу (ІІІ),  де головними морфологічними проявами були хронічний ендометрит (40%), залозисті поліпи ендометрія (10%), проста гіперплазія ендометрія (10%), гіпотрофія ендометрія (15%), невідповідність розвитку ендометрія дню м/ц (20%) .

4.  Встановлено достовірне збільшення рівнів експресії ЕР в ядрах клітин  залоз і строми та ПР ядрах клітин  залоз в ендометрії жінок з неплідністю нез'ясованого генезу  та значна мозаїчність експресії ЕР  (від відсутності до виразної вогнищевої) в ядрах клітин залоз й строми з  дисхронозом  експресії ПР ( помірна вогнищева в ядрах клітин залоз та слабкопозитивна або відсутня в ядрах клітин строми) в групі жінок з неплідністю запального генезу в порів-нянні з контрольною групою .

5. Встановлено при скануючій електронній мікроскопії зміни формування та розвитку піноподій в групі жінок з неплідністю нез’ясованого ґенезу, які проявлялися: затримкою  (50%), дисхронозом (20%), зупинкою розвитку (10%), а в групі жінок з неплідністю запального генезу переважали зміни циліарних клітин : нерівномірна  чисельність їх та гіпертрофія  війок клітин на тлі зупинки (40%) та дисхронозу (30%) розвитку піноподіальних структур.

6. В групі жінок з неплідністю нез’ясованого генезу в 15% випадків  та в групі жінок з трубно - перитонеальною формою неплідності – в 5% відмічалась наявність патологічних змін в ендометрії лише на імуногістохімічному й   електронномікроскопічному  рівнях, а  на гістологічному рівні вони були відсутні, що є важливим для діагностики цієї патології та подальшого лікування, особливо при невдачах імплантації.

7. Розроблені критерії патологічних змін ендометрія при неплідності нез’ясованого та запального генезу, які є важливими для процесів імплантації та фармакотерапії цих станів,  на різних рівнях: на структурному - відставання розвитку ендометрія від хронологічного дня м/ц, гіпотрофія ендометрія, проста  гіперплазія ендометрія, хронічний ендометрит, залозисті поліпи; імуногістохімічному - порушення експресії рецепторів до естрогенів та прогестерону в ядрах клітин залоз й строми ендометрія та при скануючій електроній мікроскопії - порушення формування та розвитку піноподій, зміни в структурі та розподілі циліарних клітин  .