Чудин Антон Вячеславович. Гемодинамические и морфологические изменения в тканях глаза при регионарной ишемии-реперфузии и возможности их коррекции (экспериментальное исследование)

Короткий опис

Чудин Антон Вячеславович. Гемодинамические и морфологические изменения в тканях глаза при регионарной ишемии-реперфузии и возможности их коррекции (экспериментальное исследование): диссертация ... кандидата Медицинских наук: 14.01.07 / Чудин Антон Вячеславович;[Место защиты: Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2016

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «МОСКОВСКИЙ НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЛАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ИМ. ГЕЛЬМГОЛЬЦА» МИНЗДРАВА РОССИИ
На правах рукописи
Чудин Антон Вячеславович
ГЕМОДИНАМИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ТКАНЯХ ГЛАЗА ПРИ РЕГИОНАРНОЙ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ КОРРЕКЦИИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
14.01.07 - глазные болезни
Д и с с е р т а ц и я
на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Научный руководитель: доктор медицинских наук,
профессор Киселева Т.Н.
Москва, 2016 г.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение 5
ГЛАВА 1. Обзор литературы.
1.1. Методы исследования микроциркуляции глаза у экспериментальных животных 13
1.2. Методы моделирования ишемического поражения глаза в эксперименте 22
1.3. Применение антиоксидантов в коррекции нарушений микроциркуляции и ретинальной ишемии в 37
эксперименте
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования.
2.1. Общая характеристика экспериментального материала 48
2.2. Способы моделирования регионарной ишемии-реперфузии глаза 53
2.3. Методы исследования в эксперименте 57
2.3.1. Объективные методы исследования 57
2.3.2. Ультразвуковые методы исследования 59
2.3.3. Методы лабораторных исследований 63
2.3.4. Методы гистологического исследования 65
2.3.5. Статистические методы обработки результатов исследования 66
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований.
3.1. Оценка состояния переднего отрезка глаза после моделирования ишемии-реперфузии 67
3.2. Результаты ультразвукового исследования глаза и орбиты в B - режиме после моделирования регионарной ишемии- реперфузии 71
3.3. Оценка гемодинамики в орбитальных сосудах у крыс до и
после моделирования регионарной ишемии-реперфузии 72
3.4. Результаты лабораторного исследования тканей глаза и сыворотки крови в эксперименте на крысах до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии 88
3.5. Результаты морфологического исследования тканей глаза в эксперименте на крысах до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии 98
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116
ВЫВОДЫ 124
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 126
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 127
Список сокращений, используемых в работе
ВГ А — верхняя глазная артерия
ВГД—внутриглазное давление
ЗДЦА - задние длинные цилиарные артерии
ЗЦВ — задняя цилиарная вена
ЛДФ-лазерная допплеровская флоуметрия
ЛДВ—лазерная допплеровская велосиметрия
НГ А — нижняя глазная артерия
СК — сыворотка крови
СРО — свободнорадикальное окисление
ТК — тканевой комплекс сетчатка-хориоидея
ЦАС — центральная артерия сетчатки
ЦВС—цилиарная вена сетчатки
ЦДК— цветовое допплеровское картирование
ЭК— энергетическое картирование
ЭРГ— электроретинограмма
ЭТ-1— эндотелин-1
BAX— белок, вызывающий апоптоз за счет активации системы проницаемости митохондриальных мембран.
BCL-2— внутриклеточный белковый фактор, негативный регулятор апоптоза.
BDNF— (brain-derived neurotrophic factor) нейротрофический фактор мозга.
sFAS—растворимая форма рецептора внешнего пути апоптоза. FasL—растворимый лиганд внешнего пути апоптоза.
GFAP (glial fi bri 11 ary acidic protei n)— глиальный кислый фибриллярный белок.
MCP— 1— моноцитарный хемоаттрактантный протеин.
NGF — (nerve growth factor) фактор роста нервов.
ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования.
Ретинальная ишемия - частая причина снижения и потери зрения, развивающаяся на фоне сосудистых заболеваний (оптические нейропатии, окклюзии ретинальных сосудов, диабетическая ретинопатия, глаукома и т. д.). Ретинальная ишемия возникает при гипоксии, когда недостаточное содержание кислорода приводит к угнетению метаболических процессов в тканях и апоптозу клеток сетчатки [157, 189]. В связи с этим остаётся актуальным вопрос изучения ишемического поражения сетчатки в эксперименте у животных для более глубокого понимания этиологии, патогенеза и выбора методов лечения данной патологии.
Известно, что транзиторные нарушения кровообращения глаза включают два периода - отсутствие кровотока (ишемия) и его восстановление (реперфузия), которые являются частью одного патологического процесса — ишемии-реперфузии. Впервые роль реперфузии в клеточном повреждении описана R. B. Jennings и соавт. [106] на модели ишемии-реперфузии миокарда у собак. В период реперфузии образуются активные формы кислорода, высвобождаются воспалительные интерлейкины, что ведет к повреждению мембран клеток, миграции лейкоцитов в очаг воспаления с усилением повреждения тканей [81].
В большинстве экспериментальных исследований моделирование ишемически-реперфузионного повреждения сетчатки осуществляется на крысах, поскольку у других животных (кролики, морские свинки) ретинальные сосуды развиты слабо [88, 115, 185].
Для создания экспериментальной модели транзиторной или временной ишемии сетчатки наиболее широко используется метод, основанный на повышении внутриглазного давления (ВГД) выше уровня системного артериального давления [98, 107, 109, 113, 161, 165, 204]. Кроме того применяют окклюзию церебральной артерии, лигирование сонных артерий, фотокоагуляцию ретинальных сосудов и введение эндотелина-1 [25, 35, 144, 179, 182, 194, 195]. До сих пор ведётся поиск наиболее оптимальной модели, отвечающей требованиям одновременно высокой экономичности, лёгкой воспроизводимости и эффективности.
Индукция регионарной ишемии в тканях глаза с помощью повышения ВГД достаточно легко воспроизводима, но имеет значительное ограничение, поскольку высокое ВГД вызывает комбинированную компрессионно-ишемическую травму, характерную для глаукомного механизма повреждения [156].
Единичные публикации посвящены использованию метода моделирования ишемии-реперфузии у животных с введением эндотелина-1 (ЭТ-1), который заключается в субконъюнктивальной, интравитреальной или внутривенной инъекции ЭТ-1.
K. Masuzawa и соавт. [144] использовали субконъюнктивальное введение ET-1 крысам в дозе 0,3 мл 4* 10-5 M, при этом перфузия восстанавливалась в течение 5-35 минут после инъекции. Позже были получены доказательства, что высокие дозы ЭТ-1 при субконъюнктивальной инъекции вызывают окклюзию ЦАС с потерей ганглиозных и активацией глиальных клеток без повреждения других тканей. Oku H. и соавт. [157, 158] продемонстрировали механизм повреждения ЭТ-1 вследствие усиления процессов свободного радикального окисления.
Модель ишемии-реперфузии с помощью ЭТ-1 легко воспроизводится, не требует операционной и специального оборудования, при этом риск возникновения инфекции минимален. К недостаткам метода относится необходимость применения высокой дозы ЭТ-1 и вероятность проникновения его в системную циркуляцию.
В настоящее время продолжается поиск и разработка способов медикаментозной коррекции ишемического-реперфузионного повреждения тканей глаза [102, 110, 133, 140, 147, 190, 198]. Показан положительный эффект при ретинальной ишемии некоторых антиоксидантов: экстракт Гинкго Билоба [93], супероксиддисмутаза [192], диметилмочевина [169], даидзеин [205] и другие. Влияние большинства, антиоксидантов и корректоров метаболизма на микроциркуляцию глаза остаётся до конца не изученным.
В последние годы внимание клиницистов привлекает ряд положительных эффектов антиоксиданта — ресвератрола, который применяется в лечении сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, метаболических расстройств. В экспериментальных исследованиях за рубежом наряду с антиоксидантным действием продемонстрированы противовоспалительные и антиангиогенные свойства ресвератрола [71, 100, 167, 197]. Установлены нейропротекторные свойства ресвератрола на основании морфофункциональных методов исследования при моделировании ишемии-реперфузии сетчатки [116, 129, 133, 198]. Однако влияние этого антиоксиданта на регионарную микроциркуляцию глаза специальному исследованию не подвергалось.
Цель. Изучить особенности глазного кровотока, нейротрофические и морфологические изменения в тканях глаза и возможность их коррекции при моделировании регионарной ишемии-реперфузии в эксперименте на крысах.
Задачи.
1. Разработать в эксперименте на крысах модели регионарной ишемии- реперфузии глаза путём повышения ВГД и с использованием субконъюнктивальной инъекции раствора эндотелина-1.
2. С помощью ультразвукового исследования сосудов орбиты в режиме трёхмерной реконструкции и энергетического картирования разработать в эксперименте 3D схему кровоснабжения глаза крысы.
3. Изучить особенности гемодинамики в сосудах глаза в эксперименте на крысах в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании регионарной ишемии-реперфузии глаза.
4. Исследовать динамику основных маркеров клеточного апоптоза, нейротрофических и воспалительных факторов в сыворотке крови и тканях оболочек глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании регионарной ишемии-реперфузии.
5. Изучить морфологические изменения в тканях оболочек глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии- реперфузии в эксперименте на крысах.
6. Изучить влияние ресвератрола на гемодинамические, нейротрофические и структурные изменения в тканях глаза в эксперименте при моделировании регионарной ишемии-реперфузии.
Научная новизна исследования.
В эксперименте на крысах созданы новые модели регионарной ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД при введении воздуха в переднюю камеру и с использованием субконъюнктивальной инъекции раствора эндотелина-1.
Разработана 3D схема кровоснабжения глаза крысы на основании 3D реконструкции изображения сосудистых структур орбиты в режиме энергетического картирования.
Впервые с использованием комплекса инструментальных, лабораторных и морфологических исследований определены ишемически- реперфузионные изменения в тканях глаза у крыс при моделировании регионарной ишемии-реперфузии глаза путем повышения ВГД и с использованием субконъюнктивальной инъекции раствора эндотелина-1.
Впервые изучены особенности глазного кровотока у крыс при моделировании регионарной ишемии-реперфузии в тканях глаза в раннем и позднем постишемическом периоде.
Впервые в эксперименте на крысах определены маркёры апоптоза, нейротрофические и воспалительные факторы в норме и их изменения в сыворотке крови и тканях оболочек глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании регионарной ишемии- реперфузии.
Установлено положительное влияние ресвератрола на гемодинамику в сосудах глаза. На модели регионарной ишемии-реперфузии у крыс доказаны ретинопротекторные, нейропротекторные и
противовоспалительные свойства ресвератрола при длительном его применении (в течение 1-2 месяцев).
Теоретическая и практическая значимость.
1. Созданы экспериментальные модели регионарной ишемии-реперфузии глаза для изучения патогенеза и разработки методов лечения ишемической патологии сетчатки. Полученные модели являются простыми, легко воспроизводимыми и не требуют дорогостоящего оборудования.
2. На основании гемодинамических, лабораторных и
патоморфологических исследований получены данные об особенностях течения раннего и позднего постишемического периода при регионарной ишемии-реперфузии глаза, которые позволят разработать в клинической практике более четкие алгоритмы ведения пациентов с сосудистой патологией глаза.
3. Экспериментальное обоснование эффективности длительного перорального применения антиоксиданта ресвератрола является основанием для последующего изучения его применения в клинической практике при ишемических поражениях глаза.
Положения, выносимые на защиту.
1. Создание в эксперименте на крысах двух моделей регионарной ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД и субконъюнктивального введения раствора эндотелина-1.
2. Регистрация нарушений гемодинамики в орбитальных сосудах в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии глаза и возможность их коррекции ресвератролом.
3. Доказательство нейротрофических и воспалительных изменений в тканях глаза (активация системы проницаемости митохондриальных мембран, клеточного апоптоза и увеличение концентрации маркеров воспаления в комплексе сетчатка-хориоидея) в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии и возможность их коррекции ресвератролом.
4. Доказательство морфологических изменений в тканях переднего и заднего отрезка глаза в раннем и позднем постишемическом периоде при регионарной ишемии-реперфузии и возможность их коррекции ресвератролом.
5. Установлено положительное влияние длительного перорального применения антиоксиданта ресвератрола на состояние глазного кровотока, нейротрофические и структурные изменения в тканях глаза при экспериментальной регионарной ишемии-реперфузии.
Внедрение результатов исследования в практику Результаты и выводы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на курсах повышения квалификации для врачей ФГБУ «Московского НИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России по программе «ультразвуковые методы исследования в офтальмологии».
Апробация работы.
Работа прошла апробацию на межотделенченской конференции ФГБУ МНИИ ГБ им. Гельмгольца Минздрава России. Основные материалы диссертационной работы доложены на научно-практических конференциях: SIDUO XXV Конгресс (Германия, Берлин 2014);
Международный офтальмологический конгресс «Белые ночи» (Санкт- Петербург, 2015); VII Российский общенациональный
офтальмологический форум «РООФ 2015» (Москва, 2015); VII Съезд российской ассоциации специалистов ультразвуковой диагностики в медицине (РАСУДМ) (Москва, 2015); II Европейский съезд молодых учёных (Испания, Овьедо, 2016).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 5 — в журналах, рецензируемых ВАК РФ.
Получено два патента РФ: патент на изобретение РФ №2577242 "Способ создания модели транзиторной ишемии сетчатки" от 11.02.2016 и патент на изобретение РФ №2577449 «Способ моделирования транзиторной ишемии сетчатки у крыс» от 15.02.2016.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 205 источников (66 отечественных и 139 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 24 рисунками. Работа выполнена в отделе ультразвуковых исследований (руководитель д.м.н., профессор Киселёва Т. Н.), на базе научного экспериментального центра (заведующая к.б.н. Щипанова А. И.), отдела патологической гистологии и анатомии (руководитель д.м.н., профессор Хорошилова-Маслова И. П.) и
лаборатории иммунологии, вирусологии и микробиологии (руководитель —
д.м.н., профессор |Слепова О. С.|, совместно с к.м.н. Балацкой Н. В.) ФГБУ «МНИИГБ им. Г ельмгольца» Минздрава России.

Список літератури

ВЫВОДЫ
1. В эксперименте на крысах разработаны две модели регионарной ишемии- реперфузии глаза: путем повышения ВГД при введении воздуха в переднюю камеру и с использованием субконъюнктивального введения раствора эндотелина-1.
2. Разработана прижизненная 3D схема кровоснабжения глаза крысы, которая показывает, что задняя цилиарная артерия (ветвь нижней глазной артерии) первоначально в орбите отдает центральную артерию сетчатки, затем у заднего полюса глаза - две задние длинные цилиарные артерии. Предложенная схема имеет существенное значение для точной регистрации показателей гемодинамики в сосудах глаза в эксперименте.
3. С помощью ультразвуковых допплеровских методов установлено стойкое снижение кровотока в центральной артерии сетчатки и задних длинных цилиарных артериях в раннем и позднем постишемическом периоде при моделировании ишемии-реперфузии глаза путём повышения ВГД и ухудшение гемодинамики во всех орбитальных артериях при моделировании с помощью субконъюнктивального введения эндотелина-1.
4. Особенностью модели регионарной ишемии-реперфузии с введением эндотелина-1 является усиление скорости кровотока (гиперперфузия) во всех исследуемых артериях через 7 суток, что свидетельствует о снижении сосудосуживающего эффекта вазоконстриктора в этот период.
5. В эксперименте установлены лабораторные маркёры ишемического повреждения тканей глаза в раннем постишемическом периоде: увеличение факторов апоптоза BAX и BCL-2, повышение концентрации моноцитарного хемоаттрактантного протеина (MCP-1) в комплексе сетчатка-хориоидея, свидетельствующие о выраженной активации клеточного апоптоза и воспалительной реакции в оболочках глаза.
6. Увеличение концентрации маркеров внешнего пути апоптоза sFas/FasL, МСР-1, нейротрофического фактора BDNF и фактора роста нервов NGF в тканях комплекса сетчатка-хориоидея через 7 суток после ишемии указывает на усиление процессов апоптоза и воспалительной реакции одновременно с активацией защитных нейропротекторных механизмов в этот период. Установлены максимальные уровни факторов апоптоза (BAX/BCL-2, sFas/FasL), маркеров воспаления (MCP-1) и нейродегенерации (GFAP) в позднем постишемическом периоде.
7. На основании данных патоморфологических исследований установлены признаки ретинальной ишемии в виде отёка сетчатки и апоптоза ганглиозных клеток в раннем постишемическом периоде. В позднем постишемическом периоде при моделировании ишемии-реперфузии путём повышения ВГД наблюдается преимущественная атрофия наружного фоторецепторного слоя сетчатки, связанная с нарушением хориоидального кровообращения в задних длинных цилиарных артериях, а при моделировании путём введения эндотелина-1 — полное разрушение нейрональных элементов, что согласуется с нарушением кровообращения во всех артериальных сосудах глаза.
В эксперименте установлены ретинопротекторные, нейропротекторные, антиангиогенные и противовоспалительные свойства ресвератрола на основании уменьшения степени неоваскуляризации роговицы, улучшения состояния гемодинамики глаза, снижения концентрации факторов клеточного апоптоза и маркеров воспаления в тканях глаза и уменьшения уровня факторов повреждения нервной ткани в сыворотке крови при регионарной ишемии-реперфузии.