Александров Андрій Володимирович Біохімічні та імунологічні показники в організмі щурів на експери­ментальній моделі прогестерон-індукованого ожиріння

Короткий опис

Александров Андрій Володимирович, асистент ка­федри біохімії ННЦ «Інститут біології» Київського націо­нального університету імені Тараса Шевченка: «Біохімічні та імунологічні показники в організмі щурів на експери­ментальній моделі прогестерон-індукованого ожиріння» (03.00.04 - біохімія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВCЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРCИТЕТ
імені ТАРАCА ШЕВЧЕНКА
Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису
АЛЕКСАНДРОВ АНДРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ
УДК: 577.112.2:612.128
ДИСЕРТАЦІЯ
БІОХІМІЧНІ ТА ІМУНОЛОГІЧНІ ПОКАЗНИКИ В ОРГАНІЗМІ
ЩУРІВ НА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ МОДЕЛІ ПРОГЕСТЕРОНІНДУКОВАНОГО ОЖИРІННЯ
03.00.04-біохімія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
Підпис: Александров А.В.
Науковий керівник
доктор біологічних наук, профеcор
Оcтапченко Людмила Іванівна
Київ, 2019

ЗМІСТ
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ СКОРОЧЕНЬ ............................................. 5
ВСТУП ........................................................................................................... 6
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ................................................................................ 14
РОЗДІЛ 1...................................................................................................... 14
1.1 Загальна характеристика проблеми ожиріння та супутніх хвороб
............................................................................................................................. 14
1.2 Основні аспекти та вплив статевих гормонів на функціонування
жирової тканини................................................................................................ 16
1.3 Будова, класифікація та властивості меланінів ............................. 23
РОЗДІЛ 2...................................................................................................... 30
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОCЛІДЖЕНЬ ........................................... 30
2.1. Реактиви та матеріали...................................................................... 30
2.2. Обладнання....................................................................................... 30
2.3. Дотримання положень про гуманне відношення до тварин........ 31
2.4. Умови проведення експерименту................................................... 31
2.5. Визначення органометричних параметрів щурів ......................... 32
2.6. Отримання сироватки крові............................................................ 32
2.7. Визначення концентрацій тригліцеридів у cироватці крові щурів
............................................................................................................................. 33
2.8. Визначення концентрацій холеcтеролу у cироватці крові щурів33
2.9. Визначення концентрацій ліпопротеїнів низької щільноcті у
cироватці крові щурів ....................................................................................... 34
2.10. Визначення концентрацій ліпопротеїнів виcокої щільноcті у
cироватці крові щурів ....................................................................................... 34
3
2.11. Визначення триптофан-гідроксилазної активності в гомогенаті
мозку щурів........................................................................................................ 35
2.12. Визначення вмісту 5-гідрокситриптофану в гомогенаті мозку
щурів................................................................................................................... 35
2.13. Визначення триптофан-декарбоксилазної активності в
гомогенаті мозку щурів .................................................................................... 36
2.14. Визначення вмісту серотоніну в гомогенаті мозку .................... 36
2.15. Вимірювання моноаміноксигеназної активності в гомогенаті
мозку щурів........................................................................................................ 37
2.16. Визначення активності індоламін 2,3-диоксигенази в гомогенаті
мозку щурів........................................................................................................ 37
2.17. Визначення концентрацій амінокислот із розгалуженим бічним
радикалом у сироватці крові щурів................................................................. 38
2.18. Визначення концентрацій про- і протизапальних цитокінів у
сироватці крові щурів ....................................................................................... 38
2.19. Визначення концентрацій білка у сироватці крові щурів.......... 39
2.20. Отримання та культивування перитонеальних макрофагів щурів39
2.21. Визначення продукції NO перитонеальними макрофагами щурів
............................................................................................................................. 40
2.22. Визначення аргіназної активності перитонеальних макрофагів
щурів................................................................................................................... 40
2.23. Визначення рівню кисень-залежного метаболізму
перитонеальних макрофагів щурів.................................................................. 41
2.24. Статистична обробка результатів................................................. 42
РОЗДІЛ 3...................................................................................................... 43
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ......................................................... 43
4
3.1. Вплив довготривалого введення прогестерону на органометричні
параметри щурів та їх харчову поведінку ...................................................... 44
3.2. Показники ліпідного обміну за умов прогестерон-індукованого
ожиріння............................................................................................................. 54
3.3. Стан системи обміну серотоніну у мозку щурів при введенні
прогестерону та рівень амінокислот з розгалуженими бічними ланцюгами у
сироватці крові щурів ....................................................................................... 56
3.4. Показники запалення у щурів з прогестерон-індукованим
ожирінням .......................................................................................................... 67
РОЗДІЛ 4...................................................................................................... 81
ВПЛИВ МЕЛАНІНУ НА ОСНОВНІ ОРГАНОМЕТРИЧНІ, БІОХІМІЧНІ
ТА ІМУНОЛОГІЧНІ ПОКАЗНИКИ ЩУРІВ ЗА УМОВ ДОВГОТРИВАЛОГО
ВВЕДЕННЯ ПРОГЕСТЕРОНУ ........................................................................... 81
4.1. Вплив меланіну на соматометричні показники щурів із
ожирінням, яке викликане довготривалим введенням прогестерону.......... 82
4.2. Вплив меланіну на харчову поведінку та обмін серотоніну у
головному мозку щурів за умов довготривалого введення прогестерону .. 87
4.3. Вплив меланіну на показники запалення у щурів при прогестероніндукованому ожирінні..................................................................................... 93
ЗАКЛЮЧЕННЯ......................................................................................... 108
ВИСНОВКИ............................................................................................... 118
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ................................................. 120

Список літератури

ЗАКЛЮЧЕННЯ
Ожиріння – це хвороба, спричинена підвищеним накопиченням жиру в
адипоцитах і, як наслідок, збільшення маси підшкірного і вісцерального жиру.
Небезпечними для здоров’я наслідками ожиріння є метаболічний синдром,
діабет, інсульт, інфаркт міокарду, онкологічні захворювання.
На сьогодні існують різні моделі ожиріння, на яких було докладно
вивчені його механізми та наслідки. Найбільш популярними є модель
ожиріння, викликаного висококалорійною дієтою, надмірним споживанням
глутамату натрію, тощо [27]. Незважаючи на велику кількість даних,
отриманих на різних моделях ожиріння, механізми розвитку ожиріння,
викликаного прогестероном, досі залишають мало вивченими.
Прогестерон використовують як препарат для контрацепції та гормон
замісної терапії. Проте, небажаним наслідком його дії є посилення споживання
їжі [5], що призводить до накопичення жиру [4, 39]. Оскільки частота випадків
ожиріння, спровокованого прогестероном, почала зростати у жінок та навіть
дівчат-підлітків, було розроблено тваринні моделі для вивчення механізмів
його розвитку [25, 41]. Дані, отримані при цьому, є фрагментарними. Тому в
даній роботі на тваринній моделі було проведено комплексне дослідження
процесів, які виникають в організмі в результаті пролонгованого введення
прогестерону. Дану модель було відтворено згідно опублікованих робіт [94,
95, 112], в яких мишам або щурам цей препарат вводили упродовж 28 діб у
дозі 10 мг / кг ваги.
Підставами стверджувати про розвиток ожиріння є , що наслідком
довготривалого введення прогестерону стало збільшення маси дослідних
тварин на кінець експерименту була на 27% (p <0,05) більшою за масу щурів
контрольної групи, а приріст індексу маси тіла у щурів експериментальної
групи був на 27% (p <0,05) більшим за показники контрольної групи тварин
109
(п.3.1.). Отриманні данні пояснюються тим, що прогестерон впливає на ріст
адипоцитів, через стимуляцію синтази жирних кислот [113]. Дієта із високим
вмістом вуглеводів стимулює експресію синтази жирних кислот, а
голодування та високий вміст ліпідів у раціоні – інгібує. Інсулін, глюкоза,
вільні жирні кислоти, цАМФ є прямими ефекторами гену синтази жирних
кислот.
За контроль транскрипції синтази жирних кислот відповідає
ADD1/SREBP1c (adipocyte determination and differentiation 1/sterol regulatory
element-binding protein 1c), який у свою чергу стимулюється інсуліном [34]. У
попередніх дослідженнях було показано, що прогестерон регулює експресію
ADD1/SREBP1c у клітинах раку молочної залози MSF7 та у культивованих
клітинах преадипоцитів отриманих з жирової тканини щурів. Отже,
прогестерон, як і інсулін, стимулює роботу синтази жирних кислот, що є
потенційним механізмом його впливу на ріст адипоцитів. Тому, ми
припускаємо, що виявлене нами збільшення маси тіла щурів, яким вводили
прогестерон, може бути наслідком симуляції синтезу жирів в адипоцитах та,
відповідно, накопичення його в них.
Також, при проведенні лапоротомії дослідних тварин ми виявили, що
щури , за умов довготривалого введення прогестерону мають в середньому у
73% (p <0,05) більшу кількість вісцеральної жирової тканини саме в області
сечо-статевої системи у порівнянні із параметрами щурів контрольної групи
(п.3.1.).
Наші результати узгоджуються з даними літератури щодо впливу
прогестерону на ліпідний обмін і його можливого зв’язку з розвитком
ожиріння. Було показано, що вісцеральний жир секретує у кров’яне русло
ретинол-зв’язуючий білок 4, який підвищує резистентність до інсуліну, що
призводить до розвитку діабету 2 типу та ожиріння [116]. Також, накопичення
в організмі жирової тканини призводить до активації ліполізу, транспорту
вільних жирних кислот у кров’яне русло. Вільні жирні кислоти у свою чергу
110
знижують утилізацію глюкози печінкою, що спричиняє збільшення секреції
інсуліну та розвитку компенсаторної гіперінсулінемії. Таким чином, активація
прогестероном синтази жирних кислот та ретинол-зв’язуючий білок 4, який
виділяється надлишковою кількістю вісцеральної жирової тканини,
призводять до розвитку ожиріння.
Для дослідження впливу харчової поведінки проводили вимірювання
кількості спожитого корму. Загальна кількість спожитого корму протягом 28
днів щурами експериментальної групи була на 17,2% (p <0,05) вищою, ніж у
контрольній групі тварин. Розглядаючи отримані результати, можна припусти,
що довготривале введення прогестерону впливає на центри насичення у
дослідних тварин. Збільшене споживання корму вказує на ймовірний вплив
прогестерону на відсутність відчуття наcичення і, як наcлідок, до збільшення
вживання їжі. За такі наслідки в організмі відповідає cеротонінергічна
cигнальна cиcтема [120]. Крім того, при переїданні центр насичення
(вентромедіальне ядро гіпоталамуcа) адаптуєтьcя до більш виcоких рівнів
глюкози, інcуліну і лептину. Результатом є те, що знижуєтьcя його чутливіcть,
і при споживанні надмірної кількості їжі відбувається недостатнє гальмування
центру голоду. Відомо, що жирова тканина синтезує гормон лептин, який
відповідає за регуляцію апетиту і енергетичного метаболізму. При зв'язуванні
лептину з відповідним рецептором відбувається внутрішньоклітинний
cигналінг та виділення cеротоніну в центрі насичення, який, у cвою чергу,
cигналізує мозку про споживання достатньої кількості їжі, після чого
знижується апетит. Також показано, що у жінок, яким призначали прогестерон
для гормон-замісної терапії, виникало збільшене споживання їжі на тлі
емоційної нестабільності (emotional eating), що призводило до значного
збільшення ваги.
Отже, ми виявили, що збільшення маси тіла щурів при введенні
прогестерону відбувається внаслідок збільшення споживання корму
тваринами і проявляється у шляхом збільшенні маси вісцеральної жирової
111
тканини, особливо біля статевих органів. Це також, ймовірно, пов’язано із
стимуляцією синтезу жирів, спровокованого прогестероном.
Так як, харчова поведінка знаходиться під контролем серотоніну, ми
досліджували рівні основних метаболітів та активності ферментів у головному
мозку щурів, які забезпечують функціонування серотонінергічної системи.
Встановлено, що концентрація триптофану – попереднику серотоніну у
головному мозку щурів після довготривалого введення прогестерону зросла в
2,16 (p <0,05) рази порівняно з контрольною групою (п. 3.2.). Першим етапом
біосинтезу серотоніну є гідроксилювання триптофану з утворенням
проміжного метаболіту - 5-гидрокситриптофану. Активність триптофангідроксилази знижувалась на 25% (p <0. 0,05) у групі щурів при тривалому
введенні прогестерону в порівнянні з контрольною групою. Концентрація 5-
гидрокситриптофану збільшилася в 2,1 рази (p <0,05) після введення
прогестерону. Активність триптофан-декарбоксилази зростала і склала 170%
(p <0.05) у порівнянні з показниками щурів контрольної групи. Концентрація
продукту триптофан-декарбоксилазной активності - серотоніну збільшилася в
3,25 рази (p <0.05) у щурів за умов довготривалого введення прогестерону.
Крім того, було досліджено рівні амінокислот із розгалуженим бічним
радикалом (валін, лейцин, ізолейцин) у сироватці крові щурів. Транспорт
BCAA та триптофану через гематоенцефалічний бар’єр відбувається за
рахунок транспортеру великих нейтральних амінокислот (LAT1).
Встановлено, що рівні валіну та лейцину були, відповідно, у 58% і 50% (p
<0,05) нижчими у щурів із ожирінням, яке було індуковане довготривалим
введенням прогестерону, ніж у щурів контрольної групи. Показане нами
зростання вмісту триптофану у головному мозку може бути обумовлене
конкуренцією даної амінокислоти з валіном та лейцином за транспорт LAT1
для проходження гематоенцефалічного бар’єру, що у свою чергу впливає на
підвищення рівню серотоніну та порушенню харчової поведінки при
довготривалому введенні прогестерону.
112
Таким чином, в результаті проведених досліджень нами встановлено
дисбаланс в системі метаболізму серотоніну в головному мозку щурів, при
розвитку гормонального ожиріння, індукованого довготривалим введенням
прогестерону, що свідчить про залучення функціонування серотонінергічної
нейротрансмітерної системи в механізми розвитку ожиріння гормонального
генезу. Серотонін впливає на емоційну сферу. Порушення процесів його
обміну може викликати емоційну нестабільність і, як наслідок, збільшення
споживання їжі.
На основі отриманих даних можна зробити висновок, тривале введення
прогестерону порушує функціонування системи метаболізму серотоніну, що
може бути пов’язаним із накопиченням ліпідів у жировій тканині і
реалізуватися через посилення споживання їжі. Тому система метаболізму
серотоніну може бути використана як потенційна мішень для корекції
метаболічного дисбалансу при розвитку гормонального ожиріння.
Загальновідомо, що ожиріння супроводжується розвитком запального
процесу, який спочатку виникає у жировій тканині у відповідь на гіпертрофію
адипоцитів внаслідок збільшення вмісту в них жиру.