СМІРНОВ ОЛЕКСАНДР ЄВГЕНОВИЧ. АЛЮМОРЕЗИСТЕНТНІСТЬ РОСЛИН РОДУ ГРЕЧКИ (FAGOPYRUM MILL.) ЗА ПІДВИЩЕНОЇ КИСЛОТНОСТІ СУБСТРАТУ

Короткий опис

СМІРНОВ ОЛЕКСАНДР ЄВГЕНОВИЧ. Назва дисертаційної роботи: "АЛЮМОРЕЗИСТЕНТНІСТЬ РОСЛИН РОДУ ГРЕЧКИ (FAGOPYRUM MILL.) ЗА ПІДВИЩЕНОЇ КИСЛОТНОСТІ СУБСТРАТУ"

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
на правах рукопису
СМІРНОВ ОЛЕКСАНДР ЄВГЕНОВИЧ
УДК 581.13:581.036
АЛЮМОРЕЗИСТЕНТНІСТЬ РОСЛИН РОДУ ГРЕЧКИ
(FAGOPYRUM Mill.) ЗА ПІДВИЩЕНОЇ КИСЛОТНОСТІ СУБСТРАТУ
03.00.12 – фізіологія рослин
Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Науковий керівник:
доктор біологічних наук, професор
Таран Наталія Юріївна
Київ - 2015
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ …………………………………………. 4
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ ………………………………… 5
РОЗДІЛ 1. ФЕНОМІКА СТІЙКОСТІ РОСЛИН ДО ДІЇ ЙОНІВ АЛЮМІНІЮ
НА КИСЛИХ ҐРУНТАХ. ...……………………………………………………. 12
1.1. Проблема алюмінієвої фітотоксичності кислих ґрунтів ....................... 12
1.2. Фітотоксичні ефекти алюмінію та клітинні мішені алюмінієвої
токсичності…………………………………………………………….. 15
1.3. Адаптивні механізми алюморезистентності вищих рослин ................ 18
1.4. Генетичний контроль формування алюморезистентності ………...... 23
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ, МЕТОДИ ТА УМОВИ ПРОВЕДЕННЯ
ДОСЛІДЖЕНЬ …………………………………………………………………. 29
2.1. Ботанічна характеристика матеріалу досліджень ……………………. 29
2.2. Схема лабораторних досліджень ……………………………………… 31
2.3. Методика вирощування рослинного матеріалу ……………………… 32
2.4. Методи досліджень ……………………………………………………. 33
2.4.1. Дослідження загального вмісту та розподілу йонів алюмінію
у вегетативній масі …………………………………………………... 33
2.4.2. Визначення морфофізіологічних показників ………………………. 33
2.4.3. Методи визначення антиоксидантного статусу ……………………. 35
2.4.4. Методи визначення показників фенольного метаболізму ………… 37
2.4.5. Математично-статистична обробка даних …………………............. 38
РОЗДІЛ 3. УЧАСТЬ КОРЕНЕВИХ ЕКСУДАТІВ РОСЛИН Fagopyrum
esculentum Moench. У ФОРМУВАННІ АЛЮМОРЕЗИСТЕНТНОСТІ …….. 39
3.1. Хелатуючі компоненти кореневих ексудатів рослин Fagopyrum
esculentum Moench. …………………………………………………… 40
3.2. Роль фенілаланін аміак-ліази у реакціях зовнішньої детоксикації йонів
алюмінію рослинами Fagopyrum esculentum Moench. ……………... 42
3
РОЗДІЛ 4. ДОЗОЗАЛЕЖНА ТА ВИДОВА СПЕЦИФІКА РЕАКЦІЙ
РОСЛИН Fagopyrum tataricum Gaertn. ТА Fagopyrum esculentum Moench. ЗА
ДІЇ РІЗНИХ КОНЦЕНТРАЦІЙ АЛЮМІНІЮ ……………………………….. 45
4.1. Морфофізіологічні особливості рослин Fagopyrum tataricum Gaertn. та
Fagopyrum esculentum Moench. за умов алюмокислого стресу ….. 45
4.2. Реакції пігментного комплексу рослин Fagopyrum tataricum Gaertn. та
Fagopyrum esculentum Moench. за умов алюмокислого стресу ….. 52
РОЗДІЛ 5. АКУМУЛЯЦІЯ ТА РОЗПОДІЛ АЛЮМІНІЮ В ОРГАНАХ
РОСЛИН Fagopyrum tataricum Gaertn. ТА Fagopyrum esculentum Moench. .. 59
РОЗДІЛ 6. ВНУТРІШНІ МЕХАНІЗМИ АЛЮМОРЕЗИСТЕНТНОСТІ
РОСЛИН Fagopyrum tataricum Gaertn. та Fagopyrum esculentum Moench. ЗА
УМОВ АЛЮМОКИСЛОГО СТРЕСУ ………………………………………. 63
6.1. Ацидофікуюча активність коренів Fagopyrum tataricum Gaertn. та
Fagopyrum esculentum Moench. на етапі проростання в умовах
алюмокислого стресу ………………………………………………… 63
6.2. Структурно-функціональні перебудови рослин Fagopyrum tataricum
Gaertn. та Fagopyrum esculentum Moench. за умов алюмокислого
стресу …………………………………………………………………. 67
6.3. Маркери оксидативного стресу та активність антиоксидантних ензимів
у різних органах Fagopyrum tataricum Gaertn. та Fagopyrum
esculentum Moench. за дії йонів алюмінію …………………………. 78
6.4. Фенольний метаболізм у різних органах рослин Fagopyrum tataricum
Gaertn. та Fagopyrum esculentum Moench. за умов алюмінієвої
токсичності …………………………………………………………... 89
РОЗДІЛ 7. АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ... 101
ВИСНОВКИ ………………………………………………………………….. 109
СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ ……………………………….. 112
4
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
ABC-транспортер – ATP-binding-cassette transporter – АТФ-спряжений
транспортер
ALMT – aluminium-induced malate transporter – алюмоіндукований
транспортер малату
MATE – multidrug and toxic compound extrusion – експортери лікарських та
токсичних сполук
QTL – quantitative traits locus – локус кількісних ознак
АФК – активні форми кисню
АА – ацидофікуюча активність
БСА – бичий сиворотковий альбумін
НСТ – нітросиній тетразолій
ОК – органічна кислота
ПАА – питома ацидофікуюча активність
ПОЛ – пероксидне окиснення ліпідів
СОД – супероксид дисмутаза
СЗК І – світозбиральний комплекс І
СЗК ІІ – світозбиральний комплекс ІІ
ТБК – тіобарбітурова кислота
ТХО – три хлороцтова кислота
УДФ-глюкоза – урідиндифосфатглюкоза
ФАЛ – фенілаланін аміак-ліаза
ФС – фенольні сполуки
ФС І – фотосистема І
ФС ІІ – фотосистема ІІ
ФТ – фактор транслокації
5
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми.
Для території України проблема підкислення орних ґрунтів актуальна
через два аспекти. По-перше значна площа середньокислих та сильнокислих
ґрунтів, які нині виявлено на 1 млн. 147 тис. га або 5 % обстеженої ріллі, і їх
площа продовжує зростати. Втрати врожаю на таких ґрунтах сягають 40 %.
По-друге, відбувається поступове підкислення чорноземів – кращих ґрунтів
України [1]. Причинами збільшення площ кислих ґрунтів в Україні є
природня декальцинація. На цей процес суттєво впливають кліматичні умови
– промивний водний режим, кислотні дощі, склад та властивості
материнської породи та неконтрольоване внесення хімічно- та фізіологічно
кислих добрив [2]. На сьогодні за даними паспортизації орних ґрунтів в
Україні [3] процеси підкислення ґрунтового покриву тривають в 15 областях.
Вони проявляються навіть в агроландшафтах Степової зони. Інтенсивність
приросту площ кислих ґрунтів різна, коливається від 1 до 14 % [4].
На кислих ґрунтах основним лімітуючим фактором росту і розвитку
рослин є фітотоксичність алюмінію. Вже при концентрації рухомого
алюмінію у 3 мг/100 г ґрунту сильно інгібуються ростові процеси. В усьому
світі втрати врожаю сільськогосподарських культур, що зростають в умовах
алюмокислого стресу можуть сягати понад 50% [5]. Алюміній у
солюбілізованій формі негативно впливає на рослинний організм,
порушуючи процеси первинного і вторинного метаболізму, спрямовані на
підтримку гомеостатичної рівноваги [6]. Тому розуміння механізмів
алюмінієвої токсичності та шляхів формування стійкості до дії йонів
алюмінію (алюморезистентності) – один з актуальних напрямків сучасної
фітофізіології.
6
Класифікувати сільськогосподарськоцінні культури за ступенем
алюморезистентності досить складно, що пов’язано із сортовою специфікою
стійкості рослин до фітотоксичної дії йонів алюмінію. У чутливих видів
внутрішньовидові відмінності за ступенем стійкості найчастіше
перевищують міжвидові. Варто зауважити, що феномен стійкості рослин до
фітотоксичності йонів алюмінію досить відносний, оскільки залежить від
генотипу та умов зростання.
Але існують види які не тільки не проявляють ознак фітотоксичності у
присутності відносно високих концентрацій йонів рухомого алюмінію у
ґрунті, а й накопичують алюміній у вегетативній масі. До таких культур
відносять традиційну українську круп’яну культуру – гречку (Fagopyrum
Mill.). Для стійких, алюморезистентних культур актуальним є дослідження
саме міжвидових відмінностей у механізмах формування
алюморезистентності для розуміння феномену стійкості рослин до
фітотоксичної дії йонів алюмінію.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дослідження за темою дисертаційної роботи виконано відповідно до
тематичних планів НДЛ «Фізіологічних основ продуктивності рослин» ННЦ
«Інститут біології» згідно програми наукових досліджень «Збереження
біорізноманіття та комплексне дослідження стратегій адаптації фіто-, зоо- та
віробіоти України з використанням біоінформаційних технологій»
(№11БФ036-02; № державної реєстрації теми: 0111U004649).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з’ясувати
видоспецифічність прояву адаптивних реакцій алюморезистентності гречки
татарської (Fagopyrum tataricum Gaertn.) та гречки звичайної (Fagopyrum
esculentum Moench.) за підвищеної кислотності субстрату. Для досягнення
цієї мети були поставлені наступні задачі:
7
1. Виявити вплив йонів алюмінію на кількісний склад хелатуючих
компонентів кореневих ексудатів рослин гречки.
2. Встановити дозозалежну та видову специфіку реакцій рослин
двох видів гречки за дії різних концентрацій алюмінію на
морфофізіологічному рівні.
3. Дослідити видові особливості акумуляції та розподілу алюмінію
в органах гречки.
4. Визначити вплив йонів алюмінію на ацидофікуючу активність
коренів двох видів гречки на стадії проростання.
5. Порівняти структурно-функціональні перебудови органів двох
видів гречки та окремих тканин рослин в умовах алюмокислого стресу.
6. Дослідити антиоксидантний статус рослин двох видів гречки за
дії йонів алюмінію.
7. Визначити вплив йонів алюмінію на накопичення фенольних
сполук та фенілаланін аміак-ліазну (ФАЛ) активність в різних органах
рослин двох видів гречки.
Об’єкт дослідження – адаптивні реакції формування
алюморезистентності рослин гречки.
Предмет дослідження – показники стійкості рослин гречки татарської
(Fagopyrum tataricum Gaertn.) та гречки звичайної (Fagopyrum esculentum
Moench.) за умов алюмокислого стресу на структурно-морфометричному,
фізіологічному та біохімічному рівнях.
Методи дослідження. Застосовувалися морфометричні методи, методи
світлової мікроскопії та аналітичного крапельного аналізу, біохімічні
(визначення ацидофікуючої активності, виділення та ідентифікації
фотосинтетичних пігментів, маркерів оксидативного стресу та
антиоксидантних ензимів, фенольних сполук та ключового ензиму їхнього
синтезу), спектрофотометричні, мас-спектрометричні, статистичного аналізу.
8
Наукова новизна отриманих результатів. На основі проведеного
комплексного дослідження адаптивних реакцій алюморезистентності
встановлено багаторівневу систему внутрішніх та зовнішніх механізмів
детоксикації йонів алюмінію. Зовнішня детоксикація йонів алюмінію
пов’язана з виділенням щавелевої кислоти кореневою системою проростків
Fagopyrum esculentum Moench. у ризосферний розчин; механізми
внутрішньої детоксикації йонів металу зумовлені зменшенням вмісту
фенольних сполук у складі кореневих ексудатів на тлі збільшення активності
ензиму фенілаланін аміак-ліази.
Встановлена дозозалежна та видова специфіка реакцій двох видів
гречки на вплив йонів алюмінію: додавання до живильного середовища йонів
алюмінію у концентрації 50 мкМ призводить до протилежно спрямованих
ефектів на морфофізіологічному рівні; стимуляція росту та розвитку за дії 50
мкМ концентрації йонів алюмінію інтерпретовані як явище гормезису у
дикого виду Fagopyrum tataricum Gaertn.
Вперше з’ясовано видоспецифічність адаптивної реакції продихового
апарату справжніх листків за дії йонів алюмінію. Виявлені (у рослин
Fagopyrum esculentum Moench.) анатомічні перебудови структури епідерми
справжніх листків, зміна (на 34%) довжини клітин-замикачів продихового
комплексу на абаксіальній поверхні, що раніше вважалося фенотипічно
стійкою ознакою. Продемонстровано, що такі структурні перебудови
забезпечують стабільність гідратури листків за умов алюмокислого стресу.
Встановлені особливості роботи ензиматичної ланки системи
антиоксидантного захисту в різних органах рослин: за дії йонів алюмінію
відбувається інтенсифікація генерації супероксидного аніон радикалу в
підземній та надземній частині обох досліджуваних видів при цьому
зафіксовано активізацію антиоксидантних ензимів – СОД, каталази,
9
неспецифічних розчинних пероксидаз, що пригнічувало вільнорадикальне
пошкодження мембран клітин.
Отримані оригінальні дані щодо специфіки фенольного метаболізму
свідчать про накопичення фенольних сполук в коренях, гіпокитилях та
листках обох досліджуваних видів, акумуляція флавоноїдів найбільш
інтенсивно відбувалась в тканинах листків. Активність фенілаланін аміакліази залежить від часу контакту органу рослини з токсикантом – на перших
етапах експозиції з наджходженням у тканин коренів, на більш пізніх – у
тканини листків. Обґрунтовано припущення щодо ролі фенольних сполук у
процесах акумуляції та розподілу йонів алюмінію у вегетативній масі рослин
гречки.
Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених
досліджень вказують на видоспецифічні особливості реакцій рослин роду
гречки за умов алюмокислого стресу на рівні цілісної рослини. Особливості
регуляції та інтеграції захисних механізмів на рівні первинного і вторинного
метаболізмів рослин призводять до формування феномену
алюморезистентності за підвищеної кислотності субстрату та пояснюють
стійкість рослин до фітотоксичних впливів йонів алюмінію. Отримані
експериментальні дані та стимулювання росту і розвитку рослин за дії йонів
алюмінію можуть бути використані для проведення скринінгу сортів за
рівнем стійкості до досліджуваного фітотоксиканта. Виявлена нами
кооперативна дія стрес-захисних реакцій може бути використана в рамках
концепції точного землеробства як основа практичних заходів з
раціонального розміщення сільгоспкультур на кислих грунтах у сучасних
технологіях агровирбництва.
Результати дисертаційних досліджень використовуються у Київському
національному університеті імені Тараса Шевченка при читанні спецкурсів
«Адаптаційний синдром рослин», «Екологія рослин», «Кореневе живлення
10
рослин», «Регуляторні системи рослин» та загального курсу «Фізіологія та
біохімія рослин». Матеріали, висвітлені у дисертації можуть бути
використані як теоретична та практична база для виконання студентами
дипломних робіт. Отримані експериментальні дані можуть бути використані
у навчальному процесі при викладанні курсу «Фізіологія та біохімія рослин»
в інших вищих навчальних закладах та при проведенні прикладних і
фундаментальних досліджень.
Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто здійснив
літературний скринінг з метою інформаційного пошуку та оцінки сучасного
стану проблематики досліджень. Розробив робочі гіпотези та виконав
модельні лабораторні дослідження для їхнього підтвердження.
Обґрунтування методологічних підходів постановки і виконання
експериментальної частини та вдосконалення і валідація розроблених
методик були здійснені з к.б.н. А.М. Косяном. Узагальнення та інтерпретація
отриманих даних були проведені з науковим керівником доктором біол. наук
Н.Ю. Таран і співробітниками к.б.н. Л.М. Бацмановою та к.б.н. О.І. Косик і
висвітлені у спільних друкованих працях.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної
роботи було представлено у доповідях на звітних наукових семінарах ННЦ
«Інститут біології» (2014-2015), всеукраїнських та міжнародних наукових
конференціях та конгресах: Международной научно-практической
конференции «Клеточная биология и биотехнология растений» (Минск,
Белоруссия, 2013); ІХ-ХІ Міжнародних наукових конференціях студентів та
аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2013, 2014, 2015); Міжнародній
науковій конференції «Фундаментальні та прикладні дослідження в біології»
(Донецьк, 2014); Международной научной конференции «Ломоносов»
(Москва, Россия, 2014); ХІ Українському біохімічному конгресі (Київ, 2014);
ІІІ Міжнародній конференції «Регуляція росту і розвитку рослин: фізіолого-
11
біохімічні та генетичні аспекти» (Харків, 2014); IX Международном
симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные
аспекты» (Москва, Россия, 2015).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових праць,
із них – 10 статей, у тому числі 6 у фахових виданнях, з яких 5 у журналах,
що входять до наукометричних баз, 1 в закордонному виданні та 8 тез
доповідей у матеріалах наукових конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з загальної
характеристики роботи, семи розділів (огляд літератури, опис матеріалу,
методів та умов проведення досліджень, чотири експериментальних розділи),
аналіз і узагальнення результатів досліджень, висновки. Робота викладена на
139 сторінках, ілюстрована 32 рисунками, містить 12 таблиць, одну схему та
один додаток. Список цитованої літератури нараховує 218 джерел

Список літератури

ВИСНОВКИ
З’ясовано видоспецифічність прояву адаптивних реакцій
алюморезистентності у рослин роду гречки. Феномен алюморезистентності
визначає широку адаптивну пластичність Fagopyrum tataricum Gaertn. та
Fagopyrum esculentum Moench. до дії йонів алюмінію та регулюється
інтеграцією багаторівневих систем механізмів внутрішньої та зовнішньої
детоксикації йонів алюмінію з проявом емерджентних властивостей рослини
як цілісної біологічної системи.
1. Встановлено, що видоспецифічною реакцією зовнішньої
детоксикації йонів алюмінію є активація синтезу та виділення щавелевої
кислоти кореневою системою проростків Fagopyrum esculentum Moench. у
ризосферний розчин. Запуск механізмів внутрішньої детоксикації йонів
металу регулюється зменшенням вмісту фенольних сполук у складі
кореневих ексудатів за індукції фенілаланін аміак-ліазної активності.
2. Встановлена дозозалежна та видова специфіка реакцій гречки на
вплив різних концентрацій (0, 25, 50, 75, 100 мкМ) йонів алюмінію з
виокремленням 50 мкМ концентрації, дія якої проявляється у специфічному
морфофізіологічному ефекті рослин гречки. 50 мкМ концентрація йонів
алюмінію у живильному розчині стимулювала фізіологічні реакції з
активацією процесів росту та розвитку проростків характеризуючи явище
гормезису у дикого виду Fagopyrum tataricum Gaertn.
3. Продемонстровано, що проростки обох видів гречки акумулюють
йони металу у вегетативних органах. Статистично значуще збільшення
вмісту йонів алюмінію (на 116% для Fagopyrum tataricum Gaertn. та на 86%
для Fagopyrum esculentum Moench.) у надземній частині та високий індекс
транслокації йонів металу (0,56 для Fagopyrum tataricum Gaertn. та 0,45 для
110
Fagopyrum esculentum Moench.) свідчать, що досліджувані види є
алюморезистентними та рослинами-акумуляторами алюмінію.
4. Вперше показано, що за дії йонів алюмінію відбувається
зниження ацидофікуючої активності коренів Fagopyrum tataricum Gaertn. та
Fagopyrum esculentum Moench. на етапі проростання, що вказує на
інгібування активності Н+
-АТФазної помпи клітин зони розтягнення кореня.
Визначені індекси толерантності (82% для Fagopyrum tataricum Gaertn. та
81% для Fagopyrum esculentum Moench.) навпаки свідчать про незначний
вплив йонів алюмінію на лінійні розміри корінця на етапі проростання в обох
досліджуваних видів.
5. Вперше встановлено, що в умовах алюмокислого стресу для
підтримання сталої гідратури проростків запускаються видоспецифічні
адаптивні реакції на рівні функціонування продихового апарату справжніх
листків. У рослин Fagopyrum tataricum Gaertn. не зафіксовано будь-яких змін
у стоматографічних параметрах при додаванні йонів алюмінію. У рослин
Fagopyrum esculentum Moench. виявлені анатомічні перебудови структури
епідерми справжніх листків в умовах алюмокислого стресу – зміна довжини
клітин-замикачів продихового комплексу на 34% на абаксіальній поверхні,
що раніше вважалося фенотипічно стійкою ознакою.
6. Виявлено, що за дії йонів алюмінію відбувається інтенсифікація
генерації супероксидного аніон радикалу в підземній та надземній частині
обох досліджуваних видів при цьому зафіксовано активізацію
антиоксидантних ензимів – СОД, каталази, неспецифічних розчинних
пероксидаз, що пригнічувало вільнорадикальне пошкодження мембран
клітин.
7. Зафіксовано, що додавання до живильного середовища йонів
алюмінію призводить до накопичення фенольних сполук в коренях,
гіпокотилях та листках обох досліджуваних видів. Аналіз вмісту окремих
111
класів фенілпропаноїдів показав, що найбільш інтенсивно акумулюються
флавоноїди в тканинах листків. Отримані дані щодо фенілаланін аміакліазної активності у динаміці вказують на активацію цього ензиму в
залежності від часу контакту органу рослини з токсикантом – на перших
етапах експозиції у тканинах коренів, на більш пізніх – у тканинах листків.