Байдакова, Галина Викторовна. Алгоритмы дифференциальной диагностики наследственных болезней обмена веществ, сопровождающихся нарушениями метаболизма аминокислот и ацилкарнитинов

Короткий опис

Байдакова, Галина Викторовна. Алгоритмы дифференциальной диагностики наследственных болезней обмена веществ, сопровождающихся нарушениями метаболизма аминокислот и ацилкарнитинов : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.02.07 / Байдакова Галина Викторовна; [Место защиты: Мед.-генет. науч. центр РАМН].- Москва, 2012.- 236 с.: ил. РГБ ОД, 61 12-3/896

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
На правах рукописи
БАЙДАКОВА ГАЛИНА ВИКТОРОВНА
АЛГОРИТМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЯМИ МЕТАБОЛИЗМА АМИНОКИСЛОТ
И АЦИЛКАРНИТИНОВ.
03.02.07 «Генетика»
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель: к.м.н. Захарова Е.Ю.
Москва, 2012
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений 6
Введение 8
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Наследственные болезни обмена веществ 13
1.2. Тандемная масс-спектрометрия 14
1.2.1. Принцип метода 16
1.2.1.1. Тандемный масс-спектрометр с ионизацией в электроспрее 16
1.2.1.2. Основные процессы, происходящие при анализе 18
1.2.1.3. Количественный масс-спектрометрический анализ 20
1.2.2. Тандемная масс-спектрометрия аминокислот 20
1.2.3. Тандемная масс-спектрометрия ацилкарнитинов 24
1.2.3.1. Нарушение окисления жирных кислот 24
1.2.3.2. Органические ацидемии 25
1.3. Применение тандемной масс-спектрометрии в диагностике наследственных болезней обмена 26
1.3.1. Аминоацидопатии, органические ацидурии, дефекты окисления жирных кислот 27
1.3.1.1. Аминокислоты 28
1.3.1.2. Ацилкарнитины 33
1.3.1.2.1. Ацилкарнитины жирных кислот 37
1.3.1.2.2. Ацилкарнитины органических кислот 40
1.3.2. Лизосомные болезни накопления 42
1.3.3. Другие наследственные болезни обмена веществ 43
1.4. Массовый скрининг новорожденных 45
1.4.1. Тандемная масс-спектрометрия в массовом скрининге новорожденных 48
1.4.2. Заболевания, выявляемые методом тандемной масс- спектрометрии 49
1.5. Селективный скрининг 53
1.6. Методы подтверждения диагноза 54
Глава 2. Материалы и методы 57
2.1. Тандемная масс-спектрометрия высушенных пятен крови 57
2.1.1. Образцы 57
2.1.2. Пробоподготовка 57
2.1.3. Масс-спектрометрический анализ 58
2.1.4. Расчет концентраций 58
2.2. Методы подтверждающей диагностики 61
2.2.1. высокоэффективная жидкостная хроматография - тандемная масс-спектрометрия органических кислот мочи 63
2.2.1.1. Определение сукцинилацетона 63
2.2.1.2. Определение оротовой кислоты 64
2.2.1.3. Определение глутаровой кислоты 65
2.2.2. Газовая хроматография - масс-спектрометрия органических кислот мочи 65
2.2.3. Определение активности биотинидазы 66
2.2.4. Молекулярно-генетические методы исследования 67
2.2.4.1. Выделение геномной ДНК 67
2.2.4.2. Метод полимеразной цепной реакции 67
2.2.4.3. Выявление частых мутаций с помощью анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) 68
2.2.4.3.1. Выявление частой мутации Arg402Trp при глутаровой ацидурии тип 1 68
2.2.4.3.2. Выявление частой мутации Lys304Glu при недостаточности среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот 68
2.2.4.3.3. Выявление частой мутации Glu474Gln при недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси- ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот 68
2.2.4.3.4. Выявление частой мутации Argl74Term при тирозинемии тип 1 69
2.2.4.3.5. Выявление частой мутации ivs 6-1 g/t при тирозинемии тип 1 69
2.2.4.3.6. Выявление частой мутации ivs 12+5 g/a при тирозинемии тип 1 69
2.2.4.3.7. Выявление частой мутации Pro342Leu при тирозинемии тип 1 70
2.2.4.4. Электрофорез в полиакриламидном геле 70
2.3. Методы статистического анализа 70
Глава 3. Результаты и обсуждение 84
3.1. Определение концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в контроле 84
3.1.1. Сравнение разных возрастных групп 85
3.1.2. Определение референсных значений 91
3.2. Спектр аминокислот и ацилкарнитинов при патологии 94
3.2.1. Нарушения обмена аминокислот 98
3.2.1.1. Фенилкетонурия 98
3.2.1.2. Другие нарушения обмена аминокислот 100
3.2.2. Органические ацидурии 103
3.2.3. Дефекты митохондриального (3-окисления 107
3.2.4. Анализ соотношений метаболитов 108
3.2.4.1. Недостаточность ДЦГАД 110
3.2.4.2. Недостаточность СПАД 114
3.3. Подтверждающая диагностика 116
3.3.1. Определение активности биотинидазы 116
3.3.2. Газовая хромамтография - масс-спектрометрия органических кислот мочи 116
3.3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография -
тандемная масс-спектрометрия 119
3.3.3.1. Определение концентрации сукцинилацетона 119
3.3.3.2. Определение концентрации оротовой кислоты 120
3.3.3.3. Определение концентрации глутаровой кислоты 120
3.4. Молекулярно-генетическая характеристика заболеваний, выявленных в ходе исследования 120
3.4.1. Спектр мутаций у пациентов с аминоацидопатиями 121
3.4.1.1. Тирозинемия тип 1 121
3.4.1.2. Лейциноз 124
3.4.1.3. Недостаточность орнитинтранскарбамилазы 125
3.4.2. Спектр мутаций у пациентов с органическими ацидуриями 126
3.4.2.1. Метилмалоновая ацидурия 127
3.4.2.2. Глутаровая ацидурия тип 1 128
3.4.3. Спектр мутаций у пациентов с дефектами (3-окисления 130
3.4.3.1. Недостаточность среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы 130
3.4.3.2. Недостаточность очень длинноцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы 131
3.4.3.3. Недостаточность длинноцепочечной 3-гидрокси ацил-КоА дегидрогеназы/Недостаточность митохондриального трифункционального белка 132
3.4.3.4. Другие дефекты (3-окисления 133
3.4.4. Частота СЦАД и ДЦГАД 134
3.5 Алгоритмы подтверждающей диагностики 135
Заключение 142
Выводы 145
Список литературы 147
Приложение 1 171
Приложение 2 179
Приложение 3 205
Приложение 4 218
Приложение 5 226

Список літератури

Выводы:
1. На основании анализа концентрации аминокислот и ацилкарнитинов в трех возрастных группах выявлено, что имеются существенные межгрупповые различия, поэтому при селективном скрининге на наследственные болезни обмена требуется определение референсных значений для разных возрастных групп.
2. В ходе обследования 8615 пациентов, направленных с предположительным диагнозом наследственные болезни обмена, выявлено 139 (1,6%) пациентов: из них с аминоацидопатиями (в том числе 23 пациента с фенилкетонурией) - 57 пациентов (41%), с органическими ацидуриями - 56 (40%), с дефектами митохондриального Р-окисления - 26 (19%). Низкий процент выявленных пациентов указывает на необходимость разработки более четких показаний к селективному скринингу на наследственные болезни обмена данным методом.
3. Анализ соотношений метаболитов позволил определить новые диагностические значимые соотношения для недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы, (C180H+C18:10H+C160H)/C0 и (С6+С8+С10:1)/(С16+С18+С18:1) соответственно, применение которых повышает чувствительность, специфичность и положительную прогностическую ценность метода тандемной масс-спектрометрии для диагностики этих заболеваний.
4. Составлены алгоритмы подтверждающей диагностики для 18 выявленных в ходе исследования форм наследственных болезней обмена, включающие ДНК-диагностику и высокочувствительные методы определения сукцинилацетона, оротовой и глутаровой кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - тандемной масс- спектрометрии.
5. При тирозинемии тип 1, глутаровой ацидурии тип 1, недостаточности
длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы и среднецепочечной
145
ацил-КоА дегидрогеназы выявлены частые мутации (IVS 6-1 G>T, IVS 12+5 G>A, Pro342Leu; Arg402Trp; Glu474Gln; Lys304Glu, соответственно) и разработаны простые, быстрые методы их детекции (ПЦР-ПДРФ анализ). Обнаружены новые мутации: 1 - при тирозинемии тип 1; 7 - при лейцинозе; 6 - при метилмалоновой ацидурии; 2 - при глутаровой ацидурии тип 1; 5 - при недостаточности очень длинноцепочечной ацил-КоА дегидрогеназы и 1 мутация de novo при недостаточности орнитинтранскарбамилазы.
Оценка частот недостаточности среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот и длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот среди новорожденных г.Москвы, рассчитанных из популяционных частот мутации Lys304Glu (0,00126 (0,00000/0,00301, при 95%-ом доверительном интервале), относительная доля мутации 0,70) и Glu474Gln (0,00346 (0,00043/0,00649, при 95%-ом доверительном интервале), относительная доля мутации 0,833) составила 1/279947 и 1/57784, соответственно. Полученная частота длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот выше, а частота среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот гораздо ниже, чем в большинстве стран Западной Европы.