Беланова, Наталья Анатольевна. Сорбционно-хроматографическое разделение и концентрирование флавоноидов с использованием наноструктурированных материалов

Короткий опис

Беланова, Наталья Анатольевна. Сорбционно-хроматографическое разделение и концентрирование флавоноидов с использованием наноструктурированных материалов : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.02 / Беланова Наталья Анатольевна; [Место защиты: Воронеж. гос. ун-т].- Воронеж, 2013.- 178 с.: ил. РГБ ОД, 61 13-2/183

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Беланова Наталья Анатольевна
СОРБЦИОННО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ФЛАВОНОИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ МАТЕРИАЛОВ
02.00.02 - Аналитическая химия
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Научный руководитель: Селеменев Владимир Федорович доктор химических наук, профессор
Научный консультант: Карпов Сергей Иванович кандидат химических наук, доцент
Воронеж 2013 
Содержание
Введение 7
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Общая характеристика полифенольных веществ 12
1.2. Некоторые химические свойства флавонидов и качественные
реакции для их определения 16
1.3. Выделение полифенольных веществ из растительного материала.. 17
1.4. Физико-химические методы в анализе полифенольных веществ 22
1.5. Выбор подвижной фазы при хроматографировании флавоноидов в
тонком слое сорбента 30
1.6. Сорбенты, применяемые при анализе флавоноидов 33
1.7. Мезопористые сорбенты І 37
1.7.1. Получение функционализированных упорядоченных
материалов 41
1.7.2. Мезопористые материалы способные к молекулярному
распознаванию 44
Заключение по главе 1 45
Глава 2. Экспериментальная часть 45
2.1. Реактивы и их сокращения 47
2.2. Получение мезопористых материалов на основе МСМ-41 48
2.2.1. Силилирование МСМ-41 48
2.2.2. Синтез мезопористых материалов с молекулярными
отпечатками 48
2.3. Определение кверцетина и (+)-катехина спектрофотометрическим
методом 49
2.4. Хроматография полифенолов в тонком слое сорбента 51
2.4.1. Способ определения флавоноидов методом ТСХ 51
2.4.2. Расчет параметров эффективности и селективности 52
2.5. Изучение сорбции кверцетина и (+)-катехина на мезопористых
материалах 53
2.5.1. Сорбция кверцетина в статических условиях 53
2.5.2. Сорбционно-хроматографическое разделение кверцетина
и (+)-катехина 54
2.6. Изучение свойств модифицированных мезопористых материалов . 55
2.6.1. Низкотемпературная адсорбция/десорбция азота 55
2.6.2. ИК-спектроскопия 55
2.6.3. Термогравиметрический анализ 56
2.6.4. Исследование гидрофобности композитных материалов по данным
конкурентной адсорбции толуола и воды 57
2.7. Способ выделения полифенольных веществ из семян винограда.... 59
2.8. Масс-спектрометрия (MALDI) флавоноидов 60
2.9. Математическая обработка результатов эксперимента 60
Глава 3. Получение модифицированных и молекулярно импринтированных материалов на основе МСМ-41 63
3.1. Силилирование мезопористого материала МСМ-41
триметилхлорсиланом 64
3.1.1. Поверхностные и объемные свойства по данным
низкотемпературной адсорбции/десорбции азота 66
3.1.2. Изучение структуры силилированных образцов по данным
рентгеноструктурного анализа 68
3.1.3. ИК-спектроскопия силилированных образцов 69
3.1.4. Исследование гидрофобности силилированных материалов по данным конкурентной адсорбции толуола и воды (по процедуре
Вейткампа) 71
3.2. Мезопористые материалы типа МСМ-41 с молекулярными отпечатками кверцетина и (+)-катехина 74
з
3.2.1. Просвечивающая электронная микроскопия мезопористых материалов типа МСМ-41 с молекулярными отпечатками кверцетина
и (+)-катехина 75
3.2.2. Низкотемпературная адсорбция/десорбция азота 76
3.2.3. Изучение структуры образцов по данным рентгеноструктурного
анализа 79
3.2.4. ИК-спектроскопия 81
3.2.5. Термогравиметрический анализ 84
3.2.6. Конкурентная адсорбция толуола и воды (по процедуре
Вейткампа) молекулярно импринтированными материалами 86
Заключение по главе 3 88
Глава 4. Сорбционно-хроматографическое разделение флавоноидов на сорбентах различной природы 91
4.1. Определение флавоноидов методом хроматографии в тонком слое
сорбента 91
4.1.1. Выбор детектирующего реагента 92
4.1.2. Выбор подвижной фазы 93
4.1.3. Влияние неподвижной фазы на разделение флавоноидов 100
4.2. Колоночная хроматография флавоноидов на кремнеземах различной
природы 102
4.3. Сорбционная способность мезопористого материала типа
МСМ-41 106
4.3.1. Сорбция кверцетина мезопористым материалом типа МСМ-41 и
композитами на его основе в статических условиях 107
4.3.2. Сорбционно-хроматографическое разделение кверцетина и (+)-катехина при совместном присутствии в динамических условиях. 114
Заключение по главе 4 119
Глава 5. Определение флавоноидов в модельных и реальных растворах хроматографическими и оптическими методами анализа 121
5.1. Количественное определение флавоноидов методом ТСХ 121
5.2. Применение спектроскопии в УФ-области для количественного
определения флавоноидов 124
5.3. Спектофотометрическое определение флаван-3-олов при
использовании ванилинового реактива 127
5.4. Спектрофотометрическое определение кверцетина и (+)-катехина в
' их бинарных растворах 128
5.5. Экстракционное выделение флаван-3-олов из семян винограда.... 131
5.6. Определение флаван-3-олов в семенах винограда 135
5.7. Количественное определение флаван-3-олов в семенах
винограда 139
5.8. Сорбционно-хроматографическое извлечение кверцетина и группы флаван-3-олов в анализе растительного сырья и фармацевтических
препаратах 142
Заключение по главе 5 144
Выводы 147
Список литературы 149
Приложение 170
Список принятых сокращений
БАВ - биологически активные вещества; •
МСМ-41 - Mobil Composition of Matter - оксид кремния с упорядоченными мезопорами;
ТЕОС - тетраэтоксисилан;
ТМХС - триметилхлорсилан;
ПАВ - поверхностно-активное вещество;
СТаВг - цетилтриметиламмония бромид;
МСі - МСМ-41, модифицированный ТМХС;
МК1 - МСМ-41, синтезированный в присутствии (+)-катехина, Цдоб) = 1-Ю'5 моль;
МК2 - МСМ-41, синтезированный в присутствии (+)-катехина, р(доб) = Т10'4 моль;
MQ1 - МСМ-41, синтезированный в присутствии кверцетина, гДдоб) = МО'5 моль;
MQ2 - МСМ-41, синтезированный в присутствии кверцетина, іДдоб) = 1-Ю'4 моль; 1
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;
ГХ - газовая хроматография;
ВЕТ - метод математического описания физической адсорбции, основанный на теории полимолекулярной (многослойной) адсорбции Брунауэра, Эммета и Теллера;
BJH - метод Барретта - Джойнера - Халенда - метод математического описания десорбции, применяемый для расчета распределения пор по размерам;
ПФ - подвижная фаза;
НФ - неподвижная фаза;
ДСК - диазотированная сульфаниловая кислота.
ФМК - фосфорномолибденовая кислота
б
Введение
Определение флавоноидов в растительном материале является непростой задачей в связи с их многообразием, а также присутствием большого количества сопутствующих компонентов. Интерес к данной группе веществ обусловлен в первую очередь их высокой антиоксидантной активностью. При извлечении из растительного сырья и биологических жидкостей человека выбор способов определения и концентрирования флавоноидов является весьма актуальным. На этапе пробоподготовки для данной цели наиболее перспективно использование сорбционно¬хроматографических методов, что позволяет сократить число стадий, а также расход токсичных растворителей. При выделении и определении флавоноидов часто используют силикагель и композиты на его основе (например, силикагель с привитыми октадецильными группами С is), целлюлозу и полиамид, которые имеют хаотичное расположение пор с широким распределением их по размеру. Такая структура материалов часто обуславливает значительные диффузионные затруднения и размывание сорбционных зон хроматографируемых веществ.
В конце прошлого века впервые был синтезирован высокоупорядоченный наноструктурированный мезопористый материал МСМ-41. По своей химической природе он идентичен силикагелю, но имеет
л
большие значения удельной площади поверхности (более 1000 м /г), узкое распределение пор по размерам (2-10 нм) гексагональной структуры, что позволяет использовать его в качестве сорбента. МСМ-41, а также модифицированные органосиланами композиты на его основе могут быть использованы в качестве альтернативы силикагелю и другим сорбентам в хроматографических процессах и для сорбционного концентрирования и выделения полифенольных веществ. Повышение селективности мезопористых сорбентов, увеличение эффективности разделения флавоноидов может быть достигнуто путем создания высокоселективных материалов на основе систем, «структурно ориентируемых», на целевой сорбат. Сведения о применении мезопористых материалов МСМ-41, модифицированных органосиланами и синтезированных в присутствии полифенольных веществ, для определения и концентрирования кверцетина и (+)-катехина в литературе отсутствуют. Поэтому разработка новых способов концентрирования и разделения флавоноидов с использованием выше описанных сорбентов является перспективной в области аналитической химии.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы Grant-00020/8/711/2012-1.2.1-12-000-1003-036. Соглашение № 14.В37.21.0804
Целью данной диссертационной работы является установление физико-химических закономерностей разделения и концентрирования флавоноидов с использованием силикагеля и высокоупорядоченных мезопористых материалов, а также разработка способов их практической реализации.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- разработать способ модификации органосиланами высокоупорядоченного материала МСМ-41, позволяющий регулировать структуру, гидрофобность, сорбционные свойства композитов по отношению к флавоноидам;
- установить влияние добавки флавоноидов при синтезе мезопористых материалов на их поверхностные свойства, структуру, гидрофобность и сорбционную способность по отношению к полифенольным веществам;
- установить зависимость эффективности разделения близких по физико-химическим свойствам полифенольных веществ от структуры, упорядоченности, гидрофобности мезопористых сорбентов;
- разработать способы количественного определения кверцетина и (+)-катехина при их совместном присутствии с использованием тонкослойной (ТСХ) и жидкостной хроматографии, твердофазной экстракции (ТФЭ), УФ-спектрофотометрии.
Научная новизна.
Показано влияние состава подвижной фазы (с учетом полярности системы), структуры и физико-химических свойств неподвижной фазы на разделение полифенольных веществ, относящихся к различным подгруппам флавоноидов, методом ТСХ.
Установлено влияние модификации мезопористых сорбентов МСМ-41, поверхностной плотности силанольных групп на сродство материала к разделяемым флавоноидам с учетом полярности подвижной фазы.
Методами низкотемпературной адсорбции/десорбции азота, просвечивающей электронной микроскопии, рентгеноструктурного анализа изучена возможность образования высокоупорядоченной гексагональной структуры, ее изменения при силилировании и синтезе материалов с молекулярными отпечатками флавоноидов. На основе данных термогравиметрии, ИК-спектроскопии, конкурентной адсорбции воды и толуола показано влияние условий синтеза и модификации на поверхностную плотность силанольных групп и гидрофобность материалов. Синтезированные сорбенты обладают большим сродством по отношению к флавоноидам по сравнению с немодифицированным силикагелем и мезопористым материалом МСМ-41.
Показано, что снижение поверхностной плотности силанольных групп и гидрофобности мезопористого материала увеличивают степень извлечения и концентрирования флавоноидов. При синтезе высокоупорядоченных материалов с молекулярными отпечатками флавоноидов удается добиться подавления каталитической активности сорбента по отношению к кверцетину и (+)-катехину по сравнению с силикагелем и исходным МСМ-41.
Предложен способ разделения и концентрирования кверцетина и (+)-катехина в динамических условиях в режиме фронтального хроматографирования с использованием силилированных материалов и мезопористых сорбентов с молекулярными отпечатками флавоноидов.
Практическая значимость. Представленные в работе результаты позволяют расширить перечень материалов для селективного сорбционного концентрирования флавоноидов. Разработаны способы силилирования МСМ- 41 и получения мезопористых материалов, «структурно настраиваемых», на целевой сорбат. Представлен способ хроматографического разделения и определения кверцетина и (+)-катехина, включающий в себя сорбционное концентрирование в колонке, заполненной мезопористыми материалами, с последующим спектральным или хроматографическим определением веществ.
Разработан способ спектрофотометрического определения флавоноидов в многокомпонентных растворах по методу Фирордта. Разработан способ хроматографического определения в тонком слое сорбента полифенолов, относящихся к различным подгруппам органических веществ: гликозидов (рутина и нарингина) и агликонов флавоноидов (кверцетина, (+)-катехина) - в их многокомпонентной смеси.
Новизна способа получения материалов с молекулярными отпечатками кверцетина и (+)-катехина и способа разделения флавоноидов подтверждена заявкой на патент № 2012118008 от 5.05.2012.
На защиту выносятся следующие положения:
- дифференцирующее влияние органического модификатора подвижной фазы на степень протонирования фенольных групп в условиях тонкослойной хроматографии на силикагеле и полиамиде приводит к увеличению хроматографического разрешения и селективности разделения гликозидов и агликонов флавоноидов;
- способы синтеза и модификации мезопористых высокоупорядоченных материалов, основанные на формировании и сохранении гексагональной наноструктуры силикатной матрицы в присутствии поверхностно активного вещества с добавками кверцетина и (+)-катехина;
- сорбционная емкость высокоупорядоченного материала МСМ-41 и композитов на его основе, а также рост коэффициентов распределения
кверцетина и (+)-катехина в системе раствор-сорбент по сравнению с силикагелем позволяют достигать увеличения степени извлечения и концентрирования флавоноидов;
- способы определения флавоноидов методами ТСХ и спектрофотометрии, позволяющие детектировать вещества при совместном присутствии в их многокомпонентных смесях с предварительным концентрированием аналитов на мезопористых материалах.
Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК. Основные результаты работы представлены и доложены на Международном конгрессе «International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006» (Moscow, 2006), Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (г. Клязьма, 2008), XIII и XIV Всероссийском симпозиуме с участием иностранных ученых «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности» (г. Клязьма, 2009 и 2010), III Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (г. Краснодар, 2011), XIII Международной конференции «Физико¬химические основы ионообменных и хроматографических процессов» (г. Воронеж, 2011), Всероссийской конференции по аналитической спектроскопии с международным участием (г. Краснодар, 2012), IV Международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (г. Белгород, 2012), VI Всероссийской конференции «Физико¬химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах - ФАГРАН-2012» (г. Воронеж, 2012).
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, включающего 191 наименование и приложения. Работа изложена на 169 страницах, содержит 56 рисунков и 25 таблиц.

Список літератури

1. Показано, что изменение состава элюента с учетом параметра полярности по Снайдеру, диэлектрической проницаемости, параметра растворимости Гильдебранта позволяет варьировать условия и возможность разделения гликозидов и агликонов флавоноидов. Отмечено, что изменением состава подвижной фазы не удается достичь удовлетворительного разделения флаван-3-олов и флавонолов. Для эффективного хроматографирования близких по природе и физико-химическим свойствам веществ необходимо учитывать структуру, пористость, а также гидрофобность сорбентов с учетом взаимодействий сорбент-сорбат-растворитель.
2. Предложен способ силилирования мезопористого материала МСМ-41 при
сохранении узкого распределения пор по размерам. Методами ИК- спектроскопии и конкурентной адсорбции воды и толуола
продемонстрирована возможность регулирования гидрофобно¬гидрофильного баланса сорбентов.
3. Впервые представлены условия получения мезопористых сорбентов в
присутствии флавоноидов. Методами низкотемпературной
адсорбции/десорбции азота и рентгеноструктурного анализа установлено, что композит с молекулярными отпечатками кверцетина и (+)-катехина имеет гексагональную структуру, узкое распределение пор по размерам. Варьирование природы и концентрации флавоноида позволяет получать сорбенты с регулируемой структурой, гидрофобностью при сохранении высокой сорбционной способности.
4. Предложены условия разделения кверцетина и (+)-катехина на
модифицированном триметилхлорсиланом композите и материале с молекулярными отпечатками флавоноидов. Использование
наноструктурированных композитов позволяет достичь увеличения
сорбционной способности, степени извлечения и селективности по отношению к кверцетину при подавлении каталитического воздействия сорбента на БАВ.
5. Разработаны способы определения флавоноидов в растительных образцах и фармпрепаратах методами ТСХ и спектрофотометрии. Определение (+)-катехина и кверцетина методом ТСХ может быть осуществлено при их относительно высоких содержаниях в объектах исследования с диапазоном концентраций для (+)-катехина (0,25-Ю)-10'2 моль/дм3, а для кверцетина (0,3-Ю,8)-10' моль/дм . Спектрофотометрическое определение флавоноидов без предварительного разделения возможно в узком диапазоне концентраций: (1,5-2,0)-10"5 моль/дм3 (Sr<0,13) и (7,0-8,0)10'5 моль/дм3 (Sr<0,08).
6. Хроматографирование смеси флаван-3-олов и флавонолов с использованием мезопористых композитов на основе МСМ-41 и наноструктурированных аналогов МСМ-41 с молекулярными отпечатками полифенольных веществ позволяет концентрировать вещества и выделять фракции индивидуальных компонентов для их дальнейшего определения методами ВЭЖХ, ТСХ, УФ-спектрофотометрии.
Автор выражает искреннюю благодарность д.х.н., проф. Ф. Ресснеру за помощь в проведении измерений методами ИК-спектроскопии и конкурентной адсорбции воды и толуола мезопористыми материалами, а также за ценные замечания при обсуждении результатов, д.х.н., проф. Буряку А.К. за предоставленную возможность изучения свойств флавоноидов методом масс-спектрометрии.