Экспериментально-клиническое обоснование применения озоно-кислородной смеси в профилактике и лечении инфицированного панкреонекроза Теплякова Ольга Валериевна

Короткий опис

Теплякова Ольга Валериевна. Экспериментально-клиническое обоснование применения озоно-кислородной смеси в профилактике и лечении инфицированного панкреонекроза: диссертация ... доктора Медицинских наук: 14.01.17 / Теплякова Ольга Валериевна;[Место защиты: ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2019.- 371 с.

Экспериментально-клиническое обоснование применения озоно-кислородной смеси в профилактике и лечении инфицированного панкреонекроза Теплякова Ольга Валериевна

ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

доктор наук Теплякова Ольга Валериевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Определение тяжести острого панкреатита: исторические аспекты, критерии и предикторы

1.2 Современные представления об этиопатогенезе гнойных осложнений острого панкреатита

1.3 Актуальные вопросы профилактики гнойных осложнений острого

панкреатита

ГЛАВА 2 ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Основные этапы исследования

2.2 Материал и методы стендовых исследований

2.2.1 Оценка параметров работы оригинального устройства для локальной обработки биологических тканей озоно-кислородной смесью

2.2.2 Сравнительная оценка эффективности бактерицидного действия озоно-кислородной смеси и растворов антисептиков на клинические штаммы MRSA, P. aeruginosa, A. baumannii в составе микробных биопленок

in vitro

2.3 Материал и методы экспериментального исследования

2.3.1 Общая характеристика экспериментальных исследований

2.3.2 Методы исследования в эксперименте

2.3.2.1 Объективная оценка тяжести состояния животных

2.3.2.2 Методы лабораторного исследования у животных

2.3.2.3 Методика бактериологического исследования в эксперименте

2.3.2.4 Методы гистологического исследования

2.4 Материал и методы клинического исследования

2.4.1 Общая характеристика пациентов

2.4.2 Оценка тяжести острого панкреатита

2.4.3 Методы лабораторного и инструментального обследования пациентов

2.4.4 Методика бактериологического исследования

2.4.5 Детекция дезоксирибонуклеиновой кислоты облигатных анаэробных микроорганизмов в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции

2.4.6 Определение в клиническом материале маркеров анаэробных микроорганизмов методом хромато-масс-спектрометрии

2.4.7 Базисный комплекс лечебных мероприятий у пациентов с острым панкреатитом тяжелой степени

2.4.8 Методика большой аутогемотерапии с озоном

2.5 Методы статистической обработки результатов

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СТЕНДОВЫХ ИСПЫТАНИЙ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ЛОКАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ НАПРАВЛЕННОГО ПОТОКА ОЗОНО-КИСЛОРОДНОЙ ГАЗОВОЙ СМЕСИ

3.1 Результаты оценки параметров работы оригинального устройства для локального применения направленного потока озоно-кислородной смеси

3.2 Результаты сравнительной оценки воздействия газообразного медицинского озона и антисептических растворов на клинические штаммы MRSA, P. aeruginosa, A. baumannii в составе микробных биопленок in vitro. . 109 ГЛАВА 4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЛОКАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ОЗОНО-КИСЛОРОДНОЙ ГАЗОВОЙ СМЕСИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ИНФИЦИРОВАННОГО ПАНКРЕОНЕКРОЗА

4.1 Влияние озоно-кислородной смеси с концентрацией озона 40 мг/л на состояние поджелудочной железы и париетальной брюшины интактных лабораторных животных

4.2 Результаты доклинической оценки эффективности локального применения озоно-кислородной газовой смеси при лечении инфицированного панкреонекроза

4.2.1 Результаты объективной оценки состояния лабораторных животных

4.2.2 Результаты лабораторных исследований в эксперименте

4.2.3 Результаты бактериологического исследования в эксперименте

4.2.3.1 Результаты качественного исследования микрофлоры перитонеального экссудата, ткани поджелудочной железы, крови лабораторных животных

4.2.3.2 Результаты количественного исследования микрофлоры перитонеального экссудата, ткани поджелудочной железы, крови лабораторных животных с моделью инфицированного панкреонекроза

4.3.4 Результаты гистологического исследования в эксперименте

ГЛАВА 5 РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕНЕНИЯ БОЛЬШОЙ АУТОГЕМОТЕРАПИИ С ОЗОНОМ В КОМПЛЕКСНОЙ ПРОФИЛАКТИКЕ ИНФИЦИРОВАННОГО ПАНКРЕОНЕКРОЗА У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМ ПАНКРЕАТИТОМ ТЯЖЕЛОЙ СТЕПЕНИ

5.1 Клинические результаты использования большой аутогемотерапии с озоном в ранней фазе течения острого панкреатита тяжелой степени

5.2 Этиологическая структура гнойных осложнений острого панкреатита тяжелой степени

5.2.1 Результаты бактериологического исследования у пациентов с острым панкреатитом тяжелой степени

5.2.2 Результаты определения чувствительности выделенных культур микроорганизмов к антибактериальным препаратам

5.2.3 Результаты идентификации облигатных анаэробных микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции в материалах пациентов с инфицированным панкреонекрозом

5.2.4 Результаты определения маркеров анаэробных микроорганизмов в материалах пациентов с острым панкреатитом тяжелой степени методом

хромато-масс-спектрометрии

ГЛАВА 6 РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕНЕНИЯ ОЗОНО-КИСЛОРОДНОЙ СМЕСИ В ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ ИНФИЦИРОВАННОГО

ПАНКРЕОНЕКРОЗА

6.1 Клинические результаты использования оптимизированной схемы

профилактики и лечения гнойных осложнений у пациентов с острым

панкреатитом тяжелой степени

6.2 Этиологическая структура гнойных осложнений острого панкреатита тяжелой степени на фоне дополнительного применения аутогемотерапии с озоном (в ранней фазе заболевания) и локальной обработки очагов панкреатогенной деструкции озоно-кислородной смесью (в фазе септической секвестрации)

6.2.1 Результаты бактериологического исследования у пациентов третьей группы с острым панкреатитом тяжелой степени

6.2.2 Результаты определения антибактериальной чувствительности культур, выделенных у пациентов с инфицированным панкреонекрозом в третьей группе

6.2.3 Результаты идентификации облигатных анаэробных микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции в материалах пациентов третьей группы с инфицированным панкреонекрозом

6.2.4 Результаты определения маркеров анаэробных микроорганизмов методом хромато-масс-спектрометрии в материалах пациентов третьей

группы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список літератури

Определение тяжести острого панкреатита: исторические аспекты, критерии и предикторы
По общему мнению практических специалистов в области неотложной абдоминальной хирургии и исследователей панкреатологов, своевременная оценка тяжести острого панкреатита остается центральным вопросом, определяющим тактику и эффективность последующего лечения [3; 179; 152; 172; 191; 243; 446]. В 1992 году на Международном симпозиуме в Атланте (США) экспертами из 15 ведущих стран мира была утверждена единая классификация острого панкреатита, в которой выделены две формы тяжести заболевания (легкая и тяжелая) и впервые представлена характеристика местных и системных осложнений [231].
В России эта классификация была пересмотрена в 2000 году на IX Всероссийском съезде хирургов в Волгограде. Отечественный вариант редакции международной классификации имел существенный акцент на морфологическое выражение патологического процесса, выделяя три формы острого панкреатита: интерстициальную (отечную), панкреонекроз стерильный и инфицированный, а также осложнения (парапанкреатический инфильтрат, панкреатогенный абсцесс, ферментативный и бактериальный перитонит, септическая флегмона забрюшинной клетчатки, аррозивное кровотечение, механическая желтуха, псевдокиста, дигестивные свищи) [40; 42; 131]. Очевидно, что в 2000 году классификация IX Всероссийского съезда хирургов отвечала насущным потребностям отечественного здравоохранения, в частности, унификации хирургической тактики при панкреонекрозе для улучшения непосредственных результатов лечения. Несомненным ее достоинством являлась простота и четкое выделение трех морфологических состояний поджелудочной железы, каждому из которых соответствовала строго детерминированная лечебная тактика: от консервативной до активной хирургической [29; 81; 83; 161]. Вместе с тем, классификация IX Всероссийского съезда хирургов не регламентировала определение тяжести процесса, что могло создавать условия для запоздалого принятия решений относительно объема интенсивной терапии или использования методов инструментальной диагностики. В определенной степени этот недостаток компенсировался резолюциями форумов, посвященных проблеме острого панкреатита; рядом уточняющих методических рекомендаций и региональных лечебно-диагностических стандартов, а также многочисленными критериями и интегральными системами оценки тяжести заболевания, внедряемыми в практику отечественного здравоохранения [43; 56; 71; 79; 85; 120; 125; 179; 174; 178; 182]. Необходимо отметить, что в разные хронологические периоды в нашей стране три степени тяжести острого панкреатита и соответствующие им клинико-лабораторные критерии выделяли следующие ученые-панкреатологи: Савельев В. С. и соавторы (1982, 1988), Филин В. И. и Костюченко А. Л. (1994), Вашетко Р. В. и соавторы (2000), Боженков Ю. Г. и соавторы (2003), Пугаев А. В. и Ачкасов Е. Е. (2007) [40; 120; 126; 127; 149].
На мировом уровне прогресс в лечении больных легким острым панкреатитом и сохраняющиеся проблемы в когорте страдающих тяжелой формой заболевания, а также достижения в области патофизиологии и лучевой диагностики, способствовали детализации тяжести процесса и соответствующему уточнению международной классификации Атланты [333]. Проект документа в 2007 году был создан экспертами рабочей группы и направлен 11 международным панкреатологическим ассоциациям, после чего неоднократно обсуждался и претерпевал изменения в ходе сетевых консультаций. Итоговый четвертый вариант классификации существенно отличался от исходного и был опубликован в 2012 году [236].
Пересмотренная международная классификация острого панкреатита выделяет две фазы (раннюю, позднюю), три степени тяжести заболевания и уточняет дефиниции соответствующих системных и локальных осложнений. Системные осложнения определены международными экспертами как моно- и полиорганные дисфункции, в том числе стойкие (сохраняющиеся на фоне интенсивной терапии более 48 часов) и преходящие (продолжительностью менее 48 часов). Кроме того, к системным осложнениям отнесено обострение сопутствующей хронической патологии, например, ишемической болезни сердца или обструктивной болезни легких [236].
В качестве инструмента первичного выявления органной дисфункции при поступлении больного регламентировано использование модифицированной шкалы Marshall J. C. и соавт. (1995 г.), которая классифицирует тяжесть повреждения сердечно-сосудистой системы, легких и почек от нуля до четырех баллов. О наличии органной дисфункции свидетельствует значение шкалы, равное двум и более баллам хотя бы по одной из систем органов [349].
Система оценки тяжести органной недостаточности, связанной с сепсисом (SOFA), рекомендуется к использованию у пациентов, нуждающихся в инотропной и респираторной поддержке [421]. Отмечается, что обе шкалы могут использоваться в отделении интенсивной терапии и реанимации (ОИТР) для ежедневного мониторинга и определения стойкости органной недостаточности у больных острым панкреатитом.
К числу местных осложнений заболевания, в соответствии с пересмотренной классификацией Атланты (2012), отнесены острые перипанкреатические жидкостные скопления, псевдокисты, панкреатические и/или перипанкреатические некрозы, а также формирование отграниченных («walled-off») секвестров в паренхиме поджелудочной железы и/или окружающих тканях [236].
Диагноз легкого острого панкреатита предполагает наиболее распространенную форму заболевания, не связанную с развитием органной дисфункции или каких-либо местных осложнений, которая обычно разрешается консервативно в течение первой недели. Умеренно тяжелый острый панкреатит характеризуется наличием транзиторной органной недостаточности и/или местных осложнений или обострением течения сопутствующей хронической патологии.
Единственным критерием развития тяжелого острого панкреатита в соответствии с положениями пересмотренной классификации Атланты (2012) является стойкая моно- или полиорганная дисфункция. При этом отмечается, что у больных с персистирующей органной недостаточностью часто развивается одно или несколько местных осложнений, уровень летальности достигает 3650 %, а присоединение инфекции делает его «экстремально высоким» [236]. Несмотря на констатацию последнего обстоятельства и разделение отграниченной и неотграниченной формы некроза, разработчики классификации считают все местные осложнения в изолированном виде равнозначными и не достаточными для определения тяжести заболевания.
Фактически одновременно с положениями пересмотренной классификации Атланты (2012) опубликована «основанная на детерминантах» международная классификация тяжести острого панкреатита. Этот документ явился результатом обсуждения панкреатологов (хирургов, гастроэнтерологов, реаниматологов, специалистов лучевой диагностики, публиковавших результаты клинических исследований по проблеме острого панкреатита в изданиях, индексируемых в библиографической базе MEDLINE с 2006 по 2010 гг.) 49 стран мира, независимо от их принадлежности к профессиональным ассоциациям [254]. Обсуждение итогового варианта документа состоялось в 2011 г. на Всемирном конгрессе Международной ассоциации панкреатологов в г. Кочи (Индия).
Как и вышеописанный аналог, классификация, основанная на детерминантах, базируется на принципах международной классификации Атланты (1992), но дополнительно помимо умеренной включает описание критической тяжести заболевания. В качестве детерминант (факторов, определяющих тяжесть острого панкреатита) рассматриваются локальные: некроз поджелудочной железы и/или перипанкреатических тканей, объединяемые термином (пери)панкреатический некроз (стерильный или инфицированный), а также системные дисфункции органов вследствие острого панкреатита, объединяемые понятием органной недостаточности [254]. Ориентиром для выявления последней служит шкала SOFA (сумма два и более баллов при условии исходного отсутствия органных дисфункций) или, если это невозможно, критерии, соответствующие двухбалльному индексу модифицированной шкалы Marshall J. C. и соавт. (1995 г.): потребность в инотропной поддержке, содержание креатинина в плазме 171 мкмоль/л, значение индекса оксигенации 300 мм рт. ст./%. В этой классификации, как и в аналоге, введены понятия персистирующей и транзиторной органной недостаточности (продолжительностью 48 часов и 48 часов, соответственно).
Согласно классификации, основанной на детерминантах, легкий острый панкреатит характеризуется отсутствием как (пери)панкреатического некроза, так и органной недостаточности. Среднюю тяжесть заболевания отличает наличие стерильного (пери)панкреатического некроза и/или транзиторной органной недостаточности. Проявлением тяжелого острого панкреатита является инфицированный (пери)панкреатический некроз или персистирующая органная недостаточность, а сочетание этих детерминант свидетельствует о критической тяжести заболевания [254].
Таким образом, обе международные классификации, опубликованные в 2012 году, для адекватного определения тяжести острого панкреатита требуют мониторинга витальных функций пациента и инструментального контроля за состоянием поджелудочной железы и окружающих тканей. Вместе с тем, при сравнительной оценке значимости системных и локальных признаков тяжести заболевания ревизованная классификация Атланты (2012) наибольшую роль отводит стойкой органной недостаточности, не дифференцируя напрямую вклад в исход стерильного или инфицированного некроза [239], в то время как классификация, основанная на детерминантах, уравнивает значимость стойкой органной дисфункции и септических осложнений [238]. Иными словами, острый панкреатит у пациента с транзиторной органной дисфункцией или без нее, но с присоединением в последующем гнойных осложнений, согласно положениям первой классификации, следует считать умеренно тяжелым, в то время как согласно принципам второй тяжелым.
Результаты оценки параметров работы оригинального устройства для локального применения направленного потока озоно-кислородной смеси
Основной технологической задачей разработки и изготовления опытного образца оригинального устройства являлась возможность локального применения направленного потока ОКС без превышения предельно допустимой концентрации (ПДК) озона в воздухе рабочего помещения. Эта задача решена за счет размещения магистрали подачи ОКС в полости отведения отработанной газовой смеси, причем сопло магистрали подачи не достигает уровня наружного отверстия контура отведения (рисунок 10), а скорость отведения отработанной газовой смеси за счет работы компрессора превышает скорость подачи в 1015 раз (в зависимости от исходной скорости расхода кислорода) [173]. Разложение остаточного озона в отработанной газовой смеси осуществляется в камере деструктора при помощи оксидно-марганцевого катализатора (гопкалита).
Сопло магистрали подачи газа удерживается в центральном положении относительно внутренних стенок контура отведения с помощью металлических держателей (см. рисунок 10). Для предотвращения разгерметизации системы и случайной утечки озона во внешнюю среду все комплектующие, непосредственно контактирующие с озоном, изготовлены из озоностойких материалов: магистраль подачи ОКС из силикона, сопло из фторопласта. Контур отведения выполнен в виде фторопластовой гофрированной трубки (рисунок 11А). Для обеспечения возможности применения как низко-, так и высокотемпературных видов стерилизации дистальный торцевой участок контура отведения (наконечник) выполнен из нержавеющей медицинской стали (рисунок 11Б) и соединен с основным (фторопластовым) участком при помощи разъемного соединения (рисунок 11А).
Внешний вид опытного образца устройства для локальной обработки биологических тканей озоно-кислородной смесью представлен на рисунке 11 Устройство работает следующим образом. Кислород в концентрации 9094 % из концентратора подается в генератор озона (см. рисунок 10), где под действием барьерного разряда происходит синтез озона из кислорода. ОКС по гибкой озоностойкой (силиконовой) магистрали подается к соплу. Отработанный газ, содержащий остаточный озон, через гофрированную фторопластовую трубку большего диаметра поступает в деструктор, где происходит каталитическое преобразование озона в кислород, далее в аспирационную камеру компрессора, после чего выводится в помещение (см. рисунок 10).
Для обеспечения возможности локального направленного использования бактерицидного эффекта газообразного озона необходимо стабильное поддержание его концентрации в подаваемой смеси, отсутствие расфокусировки потока ОКС и превышения ПДК озона в воздухе рабочего пространства.
Количество озона на выходе из генератора определяется скоростью потока кислорода, заданной на концентраторе. Зависимость между массовой концентрацией озона в ОКС и скоростью расхода кислорода для опытного образца оригинального устройства представлена в таблице 12.
При увеличении скорости подачи кислорода от 0,5 до 2,0 л/мин массовая концентрация озона в ОКС уменьшается на 32,4 % (р 0,001). Концентрация озона, необходимая и достаточная, согласно литературным сведениям, для реализации бактерицидного эффекта в отношении не только планктонных микроорганизмов, но и находящихся в составе биопленок [5; 51], обеспечивается устройством при условии расхода кислорода со скоростью 2 л/мин. Данная концентрация стабильно поддерживается на протяжении не менее 60 минут непрерывной работы генератора озона с уровнем погрешности 6,7 %.
Измерение площади обработанной ОКС поверхности осуществляли при фиксации наружного отверстия торцевого участка (наконечника) контура отведения на высоте от 1 до 50 мм. Обработку осуществляли в одной точке поверхности (над центром фильтровального диска, пропитанного 5 % раствором калия йодида) в течение 15, 30 и 60 секунд. Скорость газопотока составляла 2 л/мин, концентрация озона в ОКС (40,4 ± 2,7) мг/л.
Согласно результатам измерения, с увеличением продолжительности воздействия площадь обработанной озоном поверхности значимо не менялась (таблица 13). Независимо от времени, локального характера обработки удалось достичь при удержании наружного отверстия наконечника устройства на высоте 57 мм над поверхностью (рисунок 12). В этом случае площадь контакта озона с поверхностью в наибольшей степени соответствовала площади наружного отверстия наконечника (803,8 мм2) и повторяла его округлую форму.
В случае приближения или удаления наконечника по отношению к поверхности площадь контакта с ней озона существенно увеличивалась (р 0,001, таблица 13). Поддержание дистанции до поверхности менее 3 и более 9 мм сопровождалось появлением в помещении характерного запаха озона, что дополнительно свидетельствовало о расфокусировке потока ОКС (рисунок 13).
В последующем мониторинг концентрации озона в воздухе рабочего помещения вели при следующих параметрах работы устройства: скорость расхода кислорода 2 л/мин, концентрация озона в ОКС (40,4 ± 2,7) мг/л, расстояние от наружного отверстия наконечника до поверхности 57 мм.
Концентрация озона, превышающая порог чувствительности газоанализатора «Озон-ПДК», определялась в воздухе рабочего помещения после 4248 минут непрерывной работы устройства и в течение последующих 1218 минут составляла, в среднем, 26,9 (26,1; 28,0) мкг/м3. Это значение было ниже ПДК озона для воздуха рабочей зоны (100 мкг/м3) и средней суточной ПДК озона в атмосферном воздухе (30 мкг/м3).
Максимальная концентрация озона зарегистрирована к исходу суток на фоне 12 двухчасовых циклов непрерывной работы и выключения генератора озона и составила 48,0 мкг/м3. Этот показатель не превышал значений максимальной разовой ПДК озона в атмосферном воздухе (160 мкг/м3) и ПДК озона для воздуха рабочей зоны. Средняя суточная концентрация озона при 12-часовом (с равными перерывами) режиме функционирования устройства составила 28,8 (27,6; 38,5) мкг/м3.
Таким образом, стендовые испытания опытного образца оригинального устройства позволили определить параметры его функционирования, обеспечивающие техническую возможность проведения доклинических исследований эффективности и безопасности локального применения ОКС в лечении инфицированного панкреонекроза. Необходимая и достаточная, по литературным сведениям, концентрация озона в ОКС (40 мг/л) обеспечивается устройством при условии расхода кислорода со скоростью 2 л/мин. Площадь обработанной озоном поверхности при удержании наружного отверстия наконечника на расстоянии 57 мм не зависит от времени обработки и составляет, в среднем, (804,8 ± 7,3) мм2 (8 см2), приближаясь по форме к кругу с радиусом 16 мм. Минимальное время непрерывной работы устройства с вышеуказанными параметрами до появления в воздухе рабочего помещения озона в концентрации, регистрируемой газоанализатором «Озон-ПДК», составляет 42 минуты. Значение средней концентрации озона за сутки на фоне 12-часовой суммарной продолжительности работы устройства не превышает 109 средней суточной ПДК озона в атмосферном воздухе.