Механизмы накопления фибрилларина в ядре и ядрышке Шубина Мария Юрьевна

Короткий опис

Шубина,МарияЮрьевна.Механизмынакопленияфибрилларинавядреиядрышке: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.03.04 /ШубинаМарияЮрьевна; [Место защиты: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова]. - Москва, 2019. - 132 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
правах рукописиШубинаМарияЮрьевнаМЕХАНИЗМЫНАКОПЛЕНИЯФИБРИЛЛАРИНАВЯДРЕИЯДРЫШКЕ03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ

стр. 9
GAR-домена внакоплениифибрилларинавядре. 3. Изучить роль GAR-доменафибрилларинавнакоплениибелка вядрышке. 4. Изучить роль метилирования аргининов в

стр. 93
_____________________________________________________________________________________ Таким образом,накоплениефибрилларинав ГКядрышкаопределяется GAR-доменом. Для выявлениямеханизманакопленияфибрилларинав ГКядрышказа счет GAR-домена мы провели сайт-направленный мутагенез, в котором последовательно мутировали аргинины в составе GAR-домена на положительно

Оглавление диссертациикандидат наук Шубина Мария Юрьевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Цель и задачи исследования
Объект и предмет исследования
Научная новизна
Теоретическое и практическое значение
Методология и методы исследования
Положения, выносимые на защиту
Личный вклад автора
Степень достоверности результатов и апробация работы
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Структура фибрилларина
1.2. Структура метилтрансфераз
1.3. FBL имеет структуру типичную для метилтрансфераз
1.4. Механизмы выбора метилируемых нуклеотидов
1.5. GAR-домен фибрилларина
1.6. GAR-домены других ядерных белков
1.7. Метилирование фибрилларина
1.8. Неядрышковые функции фибрилларина
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Плазмиды
2.2. Коммерческие наборы
2.3. Культуры эукариотических клеток
2.4. Культуры прокариотических клеток
2.5. Молекулярное клонирование (получение конструктов химерных белков)
2.5.1. Получение конструктов FBL-EGFP, GAR-EGFP и AGAR-EGFP
2.5.2. Получение конструктов FBL-TagRFP, B23-TagRFP
2.5.3. Получение конструкта EGFP- NLSSV40
2.5.4. Получение конструктов FBL-lacZ-EGFP и lacZ-EGFP
2.6. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.7. Лигирование
2.8. Приготовление компетентных клеток E. coli
2.9. Трансформация E. coli плазмидной ДНК
2.10. Выделение плазмидной ДНК из E. coli
2.11. Горизонтальный гель-электрофорез ДНК
2.12. Культивирование эукариотических клеток
2.13. Трансфекция клеток HeLa плазмидной ДНК
2.14. Определение локализации FBL, AGAR и GAR-домена после ингибирования транскрипции в клетках HeLa
2.15. Фиксация клеток
2.16. Истощение клеточного пула АТФ (ATP depletion)
2.17. Слияние клеток
2.18. Прижизненные наблюдения
2.19. Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP)
2.20. Оценка эффективности накопления белков в ядре и ядрышке
2.30. Ингибирование активности импортинов
2.31. Ингибирование клеточных метилтрансфераз с помощью AdOx
2.32. Анализ взаимодействия белков в системе F2H
2.33. Сайт-направленный мутагенез
2.34 Наработка лентивирусных частиц и трансдукция
2.35 MALDI-TOF масс-спектрометрия
2.36. Работа с пекарскими дрожжами Saccharomyces cerevisiae
2.36.1. Культивирование дрожжей
2.36.2. Получение дрожжевого штамма, в котором ген дрожжевого фибрилларина NOP1 находится под контролем галактозного GAL1-промотора (W303 Pgal-NOP1:: HIS)
2.36.3. Амплификация дрожжевых генов при помощи ПЦР
2.36.4. Переосаждение ДНК
2.36.5. Выделение суммарной ДНК из дрожжей S. cerevisiae
2.36.6. Трансформация дрожжей S. cerevisiae с использованием 0.1М LiAc буфера
2.36.7. Горизонтальный гель-электрофорез ДНК
2.36.8. Молекулярное клонирование (получение конструктов химерных белков)
2.36.9. Изучение выживаемости клеток дрожжей S. cerevisiae при ингибировании экспрессии дрожжевого фибрилларина NOP1
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Дизайн экспериментов
3.2. Роль GAR-домена в функционировании фибрилларина
3.3. Роль GAR-домена в накоплении белка в ядре
3.4. Роль GAR-домена в накоплении белка в ядрышке
3.5 Роль метилирования GAR-домена в накоплении белка в ядре и ядрышке
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Для аминокислот и их производных использовались обозначения, рекомендуемые комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного союза биохимиков (IUP). В работе использовались следующие сокращения и обозначения: ГК - гранулярный компонент ядрышка мРНП - малые рибонуклеопротеидные комплексы у Архей мякРНК - малая ядрышковая РНК
мякРНП - малые ядрышковые рибонуклеопротеидные комплексы
пре-рРНК - пре-рибосомные РНК
ПФК - плотный фибриллярный компонент ядрышка
рДНК - рибосомная дезоксирибонуклеиновая кислота
рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота
ФЦ- фибриллярный центр ядрышка
aDMA - Ng ,Ng - асимметричный диметиларгинин
AdoHcy - S-аденозилгомоцистеин
AdoMet=SAM - S-аденозил-L-метионин
GAR-домен - домен фибрилларина, обогащенный глицинами и аргининами
MNA - Ng - монометиларгинин NLS - сигнал ядерной локализации NoLS - сигнал ядрышковой локализации NPC - ядерные поровые комплексы PNB - проядрышко
PRMT - белковая аргининметилтрансфераза sDMA - Ng ,Ng - симметричный диметиларгинин ЯОР - ядрышковый организатор
ВВЕДЕНИЕ