ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ У ЖИВОТНЫХ РАЗЛИЧНОГО ВОЗРАСТА ЧЕРВЯКОВА, Наталья Александровна

Короткий опис

Червякова Наталья Александровна. Пептидергическая регуляция дифференцировки лимфоидных клеток селезенки у животных различного возраста: диссертация ... кандидата Биологических наук: 14.01.30 / Червякова Наталья Александровна;[Место защиты: АННОВО Научно-исследовательский центр Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии], 2017
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИкандидат наук ЧЕРВЯКОВА/, Наталья Александровна
Список сокращений..............................................................................................................................................................................................4
Введение..................................................................................................................................................................................................................................5
Обзор литературы. Старение селезенки и пептидная регуляция функций
12
иммунной системы............................................................................................................................................................................................12
1.1. Морфо-функциональные особенности развития селезенки..............................12
1.2. Молекулярные маркеры иммунных клеток селезенки............................................26
1.3. Старение селезёнки..............................................................................................................................37
1.4. Роль пептидов и аминокислот в регуляции иммуногенеза............................47
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................58
2.1. Характеристика исследуемого материала..............................................................................................58
2.2. Характеристика и приготовление растворов аминокислот и пептидов для добавления в культуру....................................................................................................................................59
2.3. Методы клеточных культур..........................................................................................................................................62
2.3.1. Органотипическое культивирование..............................................................................................63
2.3.2. Диссоциированное культивирование............................................................................................64
2.4. Иммуноцитохимическое исследование......................................................................................................67
2.5. Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений................................................................................................................................................70
2.6. Метод молекулярного моделирования........................................................................................................70
2.7. Статистическая обработка результатов......................................................................................................72
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..............................73
3.1. Экспрессия маркера предшественников В-лимфоцитов (CD5) в культурах клеток селезенки при их старении...............................................
3.2. Экспрессия маркера ранних зрелых В-лимфоцитов (CD19) в культурах клеток селезенки при их старении.................................................
3.3. Экспрессия маркера зрелых В-лимфоцитов (CD20) в культурах клеток
селезенки при их старении............................................................................................................................82
3.4. Экспрессия маркера активированных В-лимфоцитов (CD23) в культурах клеток селезенки при их старении....................................................................................................85
3.5. Экспрессия маркера межклеточных взаимодействий В-лимфоцитов (CD40) в культурах клеток селезенки при их старении..................................................................90
3.6. Экспрессия маркера макрофагов (CD68) в культурах клеток селезенки при их старении......................................................................................................................................................................................................94
3.7. Модель взаимодействия пептида Lys-Glu и входящих в него
аминокислот с ДНК............................................................................................................................................................................................^
96
Заключение..........................................................................................................................................................................................................................102
Выводы......................................................................................................................................................................................................................................105
Практические рекомендации................................................................................................................................................................106
Указатель литературы......................................................................................................................................................................................107

Список літератури

Молекулярные маркеры иммунных клеток селезенки
Селезенка представляет собой непарный неполый орган иммунной системы, находящийся на пути крови из магистрального сосуда большого круга кровообращения аорты к печени. Селезеночные вены впадают в воротную вену печени, вследствие чего, венозная кровь, вышедшая из селезенки, прежде чем попасть в нижнюю полую вену, проходит через печень.
Гистоструктура селезенки имеет некоторые особенности, обусловленные ее функциональной направленностью, в частности, необходимостью обеспечивать как депонирование крови, так и выброс ее в кровоток, а также возможность фильтрации и очистки протекающей крови от антигенов, старых и дефектных эритроцитов и другие функции [Cesta MF.Normal structure, function, and histology of the spleen // Toxicol Pathol. 2006. Vol. 34(5). P. 455-465, Perez S.D., Silva D., Millar A.B. et al. Sympathetic innervation of the spleen in male Brown Norway rats: a longitudinal aging study. BrainRes. 2009. Vol. 1302.P. 106-117]. Так, подобно другим неполым органам, селезенка покрыта соединительнотканной капсулой, от которой внутрь органа (преимущественно в области ворот) отходят соединительнотканные трабекулы, проходящие через паренхиму селезенки, достигающие соединительнотканной капсулы на противоположной воротам выпуклой диафрагмальной поверхности органа и формирующие в совокупности соединительнотканную строму [Mustapha Z., Tahir A., Tukur M. etal. Sonographic determination of normal spleen size in an adult African population // Eur J Radiol. 2010. Vol. 75(1). P. 133-135].
В отличие от большинства других неполых органов, типичной особенностью селезенки является наличие в ее капсуле и строме большого количества эластических волокон и гладкомышечных клеток, что позволяет этим структурам растягиваться в случае необходимости (при депонировании крови в органе) и сжиматься, способствуя выбросу крови в кровоток [Mebius RE, Kraal G. Structure and function of the spleen // NatRevImmunol. 2005. Vol. 5. P. 60616]. Селезенка обладает разнообразными и недостаточно полно изученными функциями. Селезенка не принадлежит к числу жизненно важных органов, однако является наибольшим коллектором лимфоидной ткани в организме и выполняет важные гематологические и иммунологические функции, формируя генерализованный иммунный ответ всего организма на проникновение антигена, воспалительный процесс или любое другое нарушение гомеостаза организма. В селезенке обеспечивается активный и весьма длительный контакт разнообразно детерминированных иммунологически компетентных клеток с антигенами, находящимися в крови, проходящей через селезенку.
Селезенка, как самый крупный вторичный орган иммуногенеза, ответственна за эффективность клеточного и гуморального иммунного ответа, как врожденного, так и приобретенного иммунитета. Она отличается очень сложной зональностью и высокой специфичностью каждой своей зоны, определяющейся уникальным взаимодействием лимфоидных клеток и клеток стромы, создающих особое микроокружение на территории каждой из зон селезенки и обеспечивающих формирование адекватного иммунного ответа [Сапин М.Р., Биглич Г.Л. Анатомия человека. Том 1. М.: ГЕОТАР-Медиа, 2008. 608 с.].
В синусах селезенки депонируется кровь, происходит распад эритроцитов и связанный с ним обмен железа. Некоторые авторы рассматривают селезенку как бактериальный фильтр крови, играющий важную роль в борьбе с инфекцией [Duez J., Holleran JP., Ndour PA., Pionneau C., Diakit S., Roussel C., Dussiot M., Amireault P., Avery VM., Buffet PA. Mechanical clearance of red blood cells by the human spleen: Potential therapeutic applications of a biomimetic RBC filtration method // Transfus Clin Biol. 2015. pii:S1246-7820(15)00053 doi: 10.1016(Epub ahead of print)]. Кроме того, известно, что селезенка принимает участие в процессе свертывания крови, вырабатывая VIII фактор свертывания.
Наиболее важной функцией селезенки является иммунная функция. Она заключается в захвате и переработке вредных веществ, очищении крови от различных чужеродных агентов, таких как бактерии и вирусы [Chotivanich K., Udomsangpetch R., McGready R., Proux S., Newton P., Pukrittayakamee S., Looareesuwan S., White NJ. Central role of the spleen in malaria parasite clearance // J Infect Dis. 2002. Vol. 185.P. 15381541]. Селезенка захватывает и разрушает эндотоксины, нерастворимые компоненты клеточного детрита при ожогах, травмах и других тканевых повреждениях. Селезенка активно участвует в иммунном ответе - ее клетки распознают чужеродные для организма антигены и синтезируют специфические антитела [Liezmann C., Stock D., Peters E.M. Stress induced neuroendocrine-immune plasticity: A role for the spleen in peripheral inflammatory disease and inflammaging? // Dermatoendocrinol. 2012. Vol. 4(3). P. 271-279, Mamani-Matsuda M., Cosma A., Weller S. The human spleen is a major reservoir for long-lived vaccinia virus-specific memory B cells // Blood. 2008. Vol. 111.P.46534659].
Фильтрационная функция селезенки осуществляется в виде контроля за циркулирующими клетками крови. Прежде всего это относится к стареющим и дефектным эритроцитам. Физиологическая гибель эритроцитов наступает после достижения ими 120-дневного возраста. Точно не выяснено как фагоциты различают стареющие и жизнеспособные эритроциты. По-видимому, имеет значение характер происходящих в этих клетках биохимических и биофизических изменений. Например, существует предположение, согласно которому селезенка очищает циркулирующую кровь от клеток селезенки измененной мембраной. Так, при некоторых болезнях зараженные эритроциты не могут пройти через селезенку, слишком долго задерживаются в пульпе и погибают. При этом показано, что селезенка обладает лучшей, чем печень, способностью распознавать менее дефектные клетки и функционирует как фильтр.
Характеристика и приготовление растворов аминокислот и пептидов для добавления в культуру
Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания органотипических и диссоциированных культур клеток селезенки крыс проводили морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа NikonEclipseE400, цифровой камеры NikonDXM1200, персонального компьютера на базе IntelPentium 4 и программного обеспечения «VidеotestMorphology 5.2». В каждом случае анализировали 10 полей зрения при увеличении 40, 100 и 200.
Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Этот параметр характеризует количество клеток, в которых экспрессируется исследуемый маркер.
Молекулярное моделирование комплексов участков ДНК с аминокислотами лизином (Lys), глутаминовой кислотой (Glu) и пептидом вилоном (Lys-Glu) выполняли с использованием программного обеспечения Molecular Operating Environment 2012, где были визуализированы химические структуры аминокислот Lys, Glu, вилона и участков ДНК, и были рассчитаны с помощью молекулярного докинга их наиболее энергетически выгодные комплексы.
Аминокислоты и пептид вилон строили в левовращающей конформации. В качестве двухцепочечной ДНК выбирали дуплексы В-формы 5 AAAAA3 , 5 CCCCC3 , 5 ATATA3 , 5 CGCGC3 , 5 ATGCA3 , 5 GCAGC3 , 5 TGTGT3 . После построения молекулы протонировали в условиях pH 7.0, T = 310 K и 0.15 M NaCl. Затем проводили оптимизацию геометрии молекул в полноатомном силовом поле Amber12EHT, параметризованном специально для белков и нуклеиновых кислот [GerberP.R., MllerK. // J. Comput. Aided.Mol. Des. 1995. Vol. 9, N. 3. P. 251 268].
Весьма важен учет влияния растворителя на поведение всей системы. Поэтому был использован метод, в котором растворитель рассматривался как непрерывная протяженная среда вокруг молекулы растворенного вещества, что позволило оценить влияние сольватации с меньшими затратами на вычисление. Такая модель называется «обобщенное приближение Борна, GB-SA», которая описывает зарядовые взаимодействия. Влияние водной среды на систему учитывали как GB-SA с внутренней диэлектрической константой равной 1, а внешней равной 80. S xc + a Докинг является компьютерным моделированием взаимодействия между лигандом (пептидом или аминокислотой) и активным сайтом рецептора (участком ДНК). Метод докинга включал подстановку лиганда в низкоэнергетической конформации в сайт связывания и расчет оптимальной взаимной ориентации молекулы пептида и ДНК при их связывании и энтальпии (ккал/моль). Использовали «полугибкий» докинг, где учитывали конформационную подвижность только лиганда, а азотистые основания ДНК принимали как жесткие структуры. В расчетах учитывали площадь контакта, число водородных связей, параметры гидрофобных и электростатических взаимодействий. В докинге использовали силовое поле Amber 12EHT и генетический алгоритм поиска GBVI/WSA. Генетический алгоритм представляет собои оптимизационную схему, имитирующую процесс эволюции, который позволяет эффективно исследовать все доступное для лиганда пространство. После построения молекул ДНК и лиганды протонировали при pH 7 и Т=300 К. Энергию взаимодействия пептида и аминокислот с ДНК определяли величиной оценочной функции S [ккал/моль], которую рассчитывали по формуле: 2
3 (A E coui + A Era/) + A E vdw + ]3ASA weighted где c - значение потери ротационной и трансляционной энтропии комплекса; , - экспериментально определенные константы, которые зависят от силового поля; Ecoul- значение кулоновской энергии, которая рассчитывается с использованием заряда системы при диэлектрической константе равной 1; Esol -значение электростатической энергии растворителя; Evdw- Ван-дер-Ваальсовый вклад в энергию взаимодействия; SAweighted - вклад молекулярных оболочек в значение энергии.
Решения докинга ранжировали по убыванию от наиболее энергетически выгодного решения до наименее энергетически выгодного решения. Из каждого решения докинга (n=10) анализировали только первые решения, так как они являются наиболее энергетически выгодными.
Статистическая обработка экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась в программе Statisti-ca 6.0. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk s West). Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала Уоллиса). В случаях, когда дисперсионный анализ выявлял статистически значимую неоднородность нескольких выборок, для последующего выявления неоднородных групп (путем их попарных сравнений) применяли процедуры множественных сравнений с помощью U-критерия Манна-Уитни. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05.