Разработка и исследование скаффолдов на основе децеллюляризованной ткани печени для биоинженерных конструкций Боброва Мария Михайловна

Короткий опис

Боброва Мария Михайловна. Разработка и исследование скаффолдов на основе децеллюляризованной ткани печени для биоинженерных конструкций: диссертация ... кандидата Биологических наук: 14.01.24 / Боброва Мария Михайловна;[Место защиты: ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2019
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИкандидат наук Боброва Мария Михайловна
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Метод децеллюляризации как перспективная технология регенеративной медицины (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Технология децеллюляризации
1.2. Межклеточный матрикс печени
1.3. Децеллюляризации печени. Структура и состав полученного матрикса
1.4. Витализация печеночного матрикса и трансплантация рецеллюляризованной печени
1.5. Области применения технологии децеллюляризации
1.5.1. Децеллюляризация хряща
1.5.2. Децеллюляризация сухожилий
1.5.3. Децеллюляризация мышечной ткани
1.5.4. Децеллюляризация кости
1.5.5. Децеллюляризация сердца
1.5.6. Децеллюляризация почки
1.5.7. Децеллюляризация легких
1.5.8. Децеллюляризация мочевого пузыря
1.5.9. Децеллюляризация кишечника
1.6. Изделия на основе децеллюляризованного межклеточного матрикса
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Клеточные линии
2.3. Лабораторные животные
2.4. Методы
2.4.1. Децеллюляризация печени крысы
2.4.2. Анализ сосудистого русла матрикса печени крысы
2.4.3. Гистологическое исследование
2.4.4. Изучение механических свойств децеллюляризованной ткани печени крысы
2.4.5. Изучение механических свойств полученных скаффолдов
2.4.6. Получение макрочастиц из децеллюляризованной ткани печени крысы
2.4.7. Получение микрочастиц из децеллюляризованной ткани печени крысы
2.4.8. Изготовление скаффолдов в виде пленок
2.4.9. Анализ содержания ДНК в исследуемых образцах децеллюляризованной ткани
2.4.10. Анализ фракции остаточной ДНК в исследуемых образцах децеллюляризованной ткани
2.4.11. Анализ структуры образцов методом сканирующей электронной микроскопии
2.4.12. Анализ структуры образцов методом сканирующей зондовой нанотомографии
2.4.13. Анализ цитотоксичности образцов
2.4.14. Анализ пролиферативной активности клеток на децеллюляризованном матриксе
2.4.15. Анализ пролиферативной активности клеток на скаффолдах и лиофилизированных фрагментах децеллюляризованной ткани
2.4.16. Изготовление образцов децеллюляризованного матрикса печени
2.4.17. Анализ биохимического состава децеллюляризованной ткани печени
2.4.18. Биодеградация децеллюляризованного матрикса печени
2.4.19. Проведения эксперимента по заживлению полнослойной кожной раны крысы in vivo
2.4.20. Статистическая обработка результатов экспериментов ... 57 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Децеллюляризация печени крысы
3.2. Анализ сосудистой системы децеллюляризованной печени крысы
3.3. Гистологический анализ структуры полученной децеллюляризованной печени крысы
3.4. Исследование механических свойств децеллюляризованной печени крысы
3.5. Получение макрочастиц межклеточного матрикса печени крысы
3.6. Оценка пролиферативной активности клеток Hep-G2 на макрочастицах межклеточного матрикса децеллюляризованной печени крысы
3.7. Анализ содержания ДНК в исследуемых образцах децеллюляризованной ткани печени крысы
3.8. Получение лиофилизированных фрагментов децеллюляризованной ткани печени крысы
3.9. Анализ биохимического состава децеллюляризованной ткани печени
3.10. Биодеградация децеллюляризованной ткани печени
3.11. Структура конструкций на основе децеллюляризованной ткани печени крысы
3.12. Анализ цитотоксичности, адгезии и пролиферации лиофилизированных фрагментов децеллюляризованной ткани печени крысы
3.13. Проведение эксперимента по заживлению кожного покрова крысы in vivo
3.14. Получение микрочастиц межклеточного матрикса печени крысы
3.15. Изготовление скаффолдов в виде пленок на основе фиброина шелка с включенными в состав микрочастицами децеллюляризованой ткани печени
3.16. Структура скаффолдов в виде пленок на основе фиброина шелка с включенными в состав микрочастицами децеллюляризованой ткани печени
3.17. Исследование механических свойств скаффолдов
3.18. Анализ цитотоксичности, адгезии и пролиферации скаффолдов на основе фиброина шелка
3.19. Проведение эксперимента по заживлению кожного покрова крысы in vivo
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Децеллюляризация печени крысы
4.2. Композитные скаффолды в виде пленок на основе фиброина шелка
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ

Список літератури

Децеллюляризации печени. Структура и состав полученного матрикса
Цель децеллюляризации - удаление клеточного и генетического материала, при этом свести к минимуму повреждения межклеточного матрикса. В различных протоколах децеллюляризации, описанных в литературе, применяются физические, ферментативные и химические методы освобождения матрикса от клеток (Gilbert T.W., 2006). Наиболее широко используются в современных исследованиях в качестве детергентов додецилсульфат натрия и тритон Х-100 (Hussein K.H. et al., 2013; Shupe T. et al., 2010). Додецилсульфат натрия представляет собой высоко ионный детергент, который разрушает клеточные мембраны, но при высоких концентрациях в растворе (от 1%) может денатурировать белки. Напротив, тритон Х-100 является неионным детергентом, разрушает липид-липидные и липид-белковые взаимодействия, но не влияет на белок-белковые взаимодействия. Стоит так же отметить, что при использовании тритона Х-100 содержание коллагена в матриксе после процедуры децеллюляризации не изменяется, но после перфузии в матриксе содержится 60% эластина, 50% гликозоаминогликанов и 60% фактора роста гепатоцитов по сравнению с нативной тканью. В то время как при использовании 1% раствора додецилсульфата натрия содержание эластина составляло 20%, гликозоаминогликанов и фактора роста гепатоцитов содержится по 10% (Ren H. et al., 2013). Целью удаления клеточного материала межклеточного матрикса является избежание иммунного ответа на ксено - и аллогенные межклеточные матриксы (Fox I.J., Roy-Chowdhury J., 2004). Показано, что в ходе децеллюляризации путем перфузии детергентов удается удалить ксеноантигены из межклеточного матрикса печени (Hussein K.H. et al., 2013, Wang Y. et al., 2015). Перфузия органа через портальную вену с растворами детергентов является оптимальным путем децеллюляризации печени, поскольку таким методом происходит эффективная доставка детергента к клеткам и удаление дебриса из ткани. При этом, как упоминалось выше, одним из основополагающих преимуществ является сохранение глиссоновой капсулы и сосудистого русла, что демонстрируется не только перфузией раствора красителя, но и при анализе методом сканирующей электронной микроскопии. Более того, обеспечивается сохранность не только крупных сосудов, но и большинства микрокапиляров (Uygun B.E. et al.,2010). Так же методом сканирующей микроскопии показано, что после децеллюляризации в матриксе остаются структуры портальной триады печени (Baptista P.M et al., 2011). Кроме того, доказана возможность восстановления физиологического потока крови через портальную и печеночную вены (Uygun B.E. et al.,2010). При перфузии растворов детергентов через портальную вену показано сохранение пористой структуры межклеточного матрикса. Трехмерная архитектура межклеточного матрикса играет важную роль в обеспечении адгезии, пролиферации и поддержания функций гепатоцитов. Важна не только высокая пористость матрикса, но и рельеф поверхностей пор и расположения лигандов для рецепторов разных типов клеток печени (Brown D.N. et al., 2010; Badylak S.F. et al., 2009). Размер пор децеллюляризованного межклеточного матрикса составляет 20-30 мкм, что является местами расположения гепатоцитов, удаленных при децеллюляризации (Uygun B.E. et al.,2010).
Локализация специфических молекул межклеточного матрикса децеллюляризованной ткани по сравнению с нативной печенью была показана с помощью иммуногистохимического анализа. Продемонстрировано, что коллагены I, III, IV типов, ламинин и фибронектин располагаются вокруг сосудов и в паренхиме межклеточного матрикса децеллюляризованной ткани. Так же иммуногистохимия образцов нативной печени выявило, что коллагены I, III, IV типов располагаются в основном вокруг крупных сосудов, в соответствии с их локализацией в базальной мембране сосудов, и во всей паренхиме органа. Ламинин был сосредоточен около крупных сосудов и почти отсутствовал в паренхиме матрикса нативной печени. Напротив, фибронектин в большей степени располагается в паренхиме и в небольших количествах вокруг сосудов. В обоих матриксах, децеллюляризованном и нативном, матрикс вокруг желчных протоков и канальцев состоял из ламинина, фибронектина и коллагена IV типа. Помимо этого, было выявлено наличие в межклеточном матриксе декорина в количестве, сопоставимом с содержанием в нативной печени. Из этого можно сделать вывод о сохранности структуры и состава межклеточного матрикса децеллюляризованной печени (Baptista P.M et al., 2011).
Межклеточный матрикс - это не инертный компонент, а динамический регулятор функционирования клеток. Состав базальной мембраны в пределах субэндотелиального пространства влияет на поддержание различных функций гепатоцитов, звездчатых и эндотелиальных клеток. Замещение нормального матрикса интерстициальным с низкой плотностью или изменение его состава напрямую нарушает функцию гепатоцитов, что ведет за собой нарушения функций органа. Такой матрикс с высокой плотностью также активирует звездчатые клетки и ведет к уменьшению фенестрированности синусоидального эндотелия, что может препятствовать транспорту растворенных веществ из синусоида к гепатоциту. Поэтому так важно сохранение распределения компонентов межклеточного матрикса в разных участках печени (Shirakigawa N. et al., 2012).
Механические свойства матриксов были описаны как очень важные биофизические параметры для регуляции функционирования и дифференцировки клеток, а так же их морфологии (Pei M. et al., 2011). В свою очередь, механические свойства ткани печени зависят от состояния органов, метода децеллюляризации и метода измерения параметров механики (Marchesseau S. et al., 2010). По данным группы ученых под руководством Giorgio Mattei ( Mattei G. et al., 2014), при измерении модуля объемного сжатия () ткани свиной печени не наблюдается достоверных отличий в значениях этого параметра у нативной печени в различных ее долях или замороженной при -200С, что согласуется с результатами других исследований (Marchesseau S. et al., 2010; Tamura A. et al., 2002). Так же были сделаны выводы о влиянии децеллюляризации печени с ионными (0,1% SDS + 1% Triton X-100) и неионными (1% Triton X-100) детергентами на изменение модуля объемного сжатия: нативной печени составила 1,62±0,13 кПа, децеллюляризованной печени с ионными детергентами- 1,25±0,07 кПа, а с неионными 1,31±0,09 кПа. Последние две величины значительно отличаются от модуля сжатия нативной печени, позволяя сделать вывод, что удаление клеток является причиной снижения значения , а протокол децеллюляризации значительно не влияет на данный показатель. То есть сами клетки сами способствуют увеличению модуля сжатия тканей, по сравнению с межклеточным матриксом (Evans D.W. et al., 2013).
Исследование механических свойств децеллюляризованной печени крысы
Исследовано изменение механических свойств матрикса печени в зависимости от концентрации детергентов, используемых для децеллюляризации. Для регистрации значения прочности материала на разрыв (МПа) и эластичности (% удлинения), образцы подвергали деформации на разрывной машине Zwick/Roell BZ 2.5/TNIS. Значения показателей, измеренных в ходе эксперимента, представлены в таблице 1.
Образец 1- Печень крысы, децеллюляризованная 0,1% раствором додецилсульфат натрия, содержащим 1% тритона Х-100, Образец 2- Печень крысы, последовательно децеллюляризованная 0,1% растворами додецилсульфат натрия, содержащими 1% и 2% тритона Х-100, Образец 3- Печень крысы, последовательно децеллюляризованная 0,1% растворами додецилсульфат натрия, содержащими 1%, 2% и 3% тритона Х-100. Указаны значения стандартного отклонения для 5 независимых измерений. Рисунок 5. Гистограмма сравнения эластичности децеллюляризованной печени крысы, полученной при разных условиях Образец 1- Печень крысы, децеллюляризованная 0,1% раствором додецилсульфат натрия, содержащим 1% тритона Х-100, образец 2- Печень крысы, последовательно децеллюляризованная 0,1% растворами додецилсульфат натрия, содержащими 1% и 2% тритона Х-100, образец 3- Печень крысы, последовательно децеллюляризованная 0,1% растворами додецилсульфат натрия, содержащими 1%, 2% и 3% тритона Х-100. Указаны значения стандартного отклонения для 5 независимых измерений.
Таким образом, наиболее прочными и эластичными являются образцы печени крысы, последовательно децеллюляризованной 0,1% растворами додецилсульфат натрия, содержащим 1%, 2% и 3% тритона Х-100.