Разработка культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек Раев, Сергей Алексеевич

Короткий опис

Раев Сергей Алексеевич. Разработка культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек : диссертация ... кандидата ветеринарных наук : 16.00.03 / Раев Сергей Алексеевич; [Место защиты: Моск. гос. ун-т приклад. биотехнологии].- Москва, 2009.- 104 с.: ил. РГБ ОД, 61 10-16/8
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИкандидат ветеринарных наук Раев, Сергей Алексеевич
Оглавление.
Список используемых сокращений.
1. Введение.
2. Обзор литературы.
2.1. Характеристика возбудителя вирусной лейкемии кошек
2.1.1 История.
2.1.2 Таксономия и классификация возбудителя.
2.1.3 Вирион и структура генома.
2.2. Эпизоотология заболевания.
2.3. Особенности патогенеза.
2.4. Клинические симптомы.
2.5. Методы диагностики вирусной лейкемии кошек.
2.6. Лечение.
2.7. Средства специфической профилактики.
3. Собственные исследования.
3.1 Материалы и методы.
3.1.1 Вирусы, культуры клеток и питательные среды.
3.1.2 Определение количества и жизнеспособности клеток.
3.1.3 Криоконсервация культуры клеток.
3.1.4 Инактивация вируса.
3.1.5 Адъюванты.
3.1.6 Определение стерильности.
3.1.7 Экспериментальные животные.
3.1.8 Выделение РНК.•.
3.1.9 Амплификация и клонирование гена gp70 в E.coli.
3.1.10 Приготовление питательной среды LB и L-arapa.
3.1.11 Получение компетентных клеток.
3.1.12 Трансформация компетентных клеток E.coli.
3.1.13 Наращивание.
3.1.14 Индукция.
3.1.15 Сыворотки.
3.1.16 Очистка рекомбинантного белка rgp70 методом металло-хелатной аффинной хроматографии (МХАХ).
3.1.17 Определение концентрации белка.
3.1.18 Оценка иммунологической активности белка rgp70.
3.1.19 Учет и интерпретация результатов ИФА.
3.1.20 Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН).
3.1.21 Статистическая обработка результатов.
3.2 Результаты собственных исследований.
3.2.1 Изучение условий культивирования культуры клеток F422.
3.2.2 Инактивация вируса.
3.2.3 Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на лабораторных животных.
3.2.4 Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на кошках.
3.2.5 Изготовление и контроль опытных серий вакцины против вирусной лейкемии кошек.
3.2.6 Получение и характеристика рекомбинантного оболочечного гликопротеина ВЖ gp70 (rgp70).
3.2.7 Разработка тест-системы по определению антител к оболочечному гликопротеину вируса лейкемии кошек gp70.
4. Обсуждение.
5. Выводы.
6. Практические предложения.

Список літератури

Введение к работе
1.1.Актуальность работы.Вирус лейкемии кошек (Feline leukaemia virus, FeLV или ВЛК) - РНК-содержащий вирус семействаRelroviridae,является одним из наиболее распространенных возбудителей инфекционных заболеваний кошек. В США, где система по обнаружению и изоляции инфицированных животных, а также профилактической вакцинации кошек действует в течение 20 лет, распространенность данного заболевания (среди клинически здоровых животных) составляет 2%. У больных особей, и кошек, принадлежащих к группе риска, эта цифра варьируется от 6 до 33% (Hartmann С, 2006). Инфицированность животных вирусом лейкемии в Центрально-Черноземном районе Российской Федерации достигает 12,6% (Федосов Д.В., 2007). В связи с этим, контроль за распространением заболевания и профилактика лейкемии кошек является актуальной проблемой.
Основной путь передачи вируса - горизонтальный, также возможно трансплацентарное инфицирование плода. В организме животных вирус вызывает дегенеративные, пролиферативные и неопластические процессы в клетках гемопоэтического ряда. У персистентно инфицированных кошек это приводит к лейкемии, фибросаркомам или, чаще всего, к супрессии иммунной системы животного, на фоне которой проявляются оппортунистические инфекции (Hardy W.D., 1980).
Основной метод контроля за распространением инфекции, вызываемой ВЛК, - выявление и изоляция инфицированных животных (Hartmann С, 2006), а также профилактическая вакцинация кошек. Вакцинированные кошки, у которых происходит синтез вируснейтрализующих антител к поверхностному гликопротеину gp70 ВЛК подгруппы А, устойчивы к заражению вирулентным штаммом вируса (Russell Р.Н., 1978).
За рубежом для специфической профилактики вирусной лейкемии кошек разработано несколько видов вакцин, причем установлено, что культуральная инактивированная и рекомбинантная субъединичная вакцины обладают наибольшей эффективностью (Sparkes А.Н., 1997).
1.2.Цель и задачи исследований.Целью настоящей работы является разработка культуральнои инактивированнои вакцины против вирусной лейкемии кошек и методов определения ее антигенной активности.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Оптимизировать условия культивирования культуры клеток F422 дляполучения максимального выхода поверхностного гликопротеина gp70 ВЛК.
2. Отработать условия инактивации культуралыюго ВЛК.З.Приготовить экспериментальные серии культуральнои
инактивированнои вакцины против вирусной лейкемии кошек.
4. Изучить безвредность, реактогенность и антигенную активность экспериментальных серий культуральнои инактивированнои вакцины против ВЛК на кошках и лабораторных животных.

Определить оптимальную иммунизирующую дозу, способ и схему введения культуральной инактивированиой вакцины для получения напряженного и длительного иммунитета к ВЛК у иммунизированных животных.

Получить рекомбинантный белок rgp70 вируса лейкемии кошек и использовать его в иммуноферментном анализе для определения уровня антител к gp70 ВЛК в сыворотке крови кошек.

І.З.Научная новизна.Изысканы оптимальные условия культивирования перевиваемой хронически инфицированной вирусом лейкемии кошек культуры клеток и определены оптимальные условия его накопления.
Отработаны режимы инактивации вируса
Разработана схема изготовления культуральной инактивированиой вакцины против ВЛК.
Определена безвредность и антигенная активность культуральной инактивированиой вакцины против ВЛК на кроликах и кошках.
Изучено влияние хранения на антигенную активность вакцины.
Подобраны праймеры для амплификации гена gp70.
Получен и охарактеризован рекомбинантный оболочечный гликопротеин вируса лейкемии кошек (rgp70).
Разработана иммуноферментная тест-система для выявления вирус-специфических антител к оболочечному гликопротеину gp70 ВЛК в сыворотке крови кошек.
ІЛ.Практтеская ценность работы.Разработана безвредная и эффективная инактивированная вакцина против вирусной лейкемии кошек.
Научно обоснованы принципы изготовления и биологического контроля инактивированиой вакцины против вирусной лейкемии кошек.
Экспериментально установлена иммунизирующая доза препарата, показана возможность оценки антигенной активности на лабораторных и естественно-восприимчивых животных.
Разработана нормативная документация на культуральную инактивированную вакцину против вирусной лейкемии кошек.
Разработана иммуноферментная тест-система для определения уровня антител к gp70 ВЛК в сыворотке крови кошек.
1.5.0сновные положения, выносимые на защиту.Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:
-схема изготовления и методы биологического контроля вакцины против вирусной лейкемии кошек,
-результаты исследований по изучению антигенных свойств культуральной инактивированиой вакцины против ВЛК на лабораторных и естественно-восприимчивых животных,
- разработка иммуноферменпой тест-системы по определению уровня антител к оболочечному гликопротешу gp70 ВЛК в сыворотке крови кошек.
І.б.Апробация работы.Основьые положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 6-ой Меадународной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2007); 7-ой Международной конферщции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая бдопасность населения» (2008); 2-ой ежегодной конференции молодых ученее ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; заседании Ученого совета МГУПБ (2009), межлабораторном совещании МГУПБ.
1.7.Публикация результатов исстдоважй.По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.
1.8. Объем и структура работы.Рібота выполнена на базе НПО «НАРВАК». Диссертация ізложена на 109 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, пракіические предложенгя и список литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 8 рисункіми. Список использованной литературы включает 119 отечественных и зарубокных авторов.
Методы диагностики вирусной лейкемии кошек
Вирусные частицы округлой формы, около 100 нм в диаметре, состоящие из сердцевины с одноцепочечной РІЖ и наружной оболочки.
Сердцевина инкапсидирует геном вируса, который, как и в случае других представителей этого семейства, представлен двумя линейными одноцепочечными молекулами РНК в виде димера. РНК вируса имеет 5 кэп и полиадениловый хвост на 3 конце. Длина генома составляет около 8кЬ в длину. С обоих концов генетическая последовательность содержит длинные концевые повторы (long terminal repeats-LTRs), которые не кодируют белки, но выполняют регулирующую функцию и управляют экспрессией других вирусных генов. Схематично, от 5 к 3 концу геном выглядит следующим образом: LTR-gag-pol-env-LTR. В составе миелоидных лейкемий кошек внутри LTR часто встречаются регуляторные последовательности, обладающие энхансерными свойствами (URE), что послужило основанием выдвинуть предположение, что эта область генома вируса связана с онкогенезом (Hartmann С, 2006).
На своей поверхности частицы вируса имеют шипы, состоящие из мультимеров двух белков, которые кодирует оболочечный (env) ген: gp70 -поверхностный гликопротеин и р15Е - трансмембранный протеин. Оболочечный белок gp70 является группоспецифическим и имеет большое значение с точки зрения специфической профилактики, так как антитела к этому белку являются вируснейтрализующими, что стало основанием для использования этого белка как основного компонента вакцин против вирусной лейкемии кошек (Salerno R.A., et. al, 1978; Pedersen N.C. et. al.s 1986; Sparkes A.H., 2003). По данным Mathes L. E., трансмембранный белок р15е препятствует развитию клеточного иммунитета, что облегчает персистенцию вируса (Mathes L. Е., et. al., 1978).
Ген полимеразы (рої) "кодирует обратную транскриптазу (ревертазу), протеазу и интегразу; ген группоспецифического (gag) гена кодирует структурные белки вируса: главный группоспецифический белок р27 и р15. Gag белок р27, который используется в серологической? диагностике ВЛК, присутствует в большом количестве в цитоплазме зараженных клеток, а также в плазме инфицированных кошек, что является причиной доступности для большинства диагностических тест-систем: иммуноферментного анализа и метода флуоресцирующих антител, разработанных для обнаружения этого белка. Свободный р27 не только циркулирует в плазме, но также может содержаться в слезах и слюне. Другой продукт gag гена р10 - белок нуклеокапсида, ассоциирован с вирионной РНК (Coffin J. М., 1979).
На основе реакции нейтрализации, интерференции, способности размножаться в культурах клеток, а также на основании различий в генетической последовательности поверхностного гликопротеина вируса, ВЛК был разделен на подгруппы: ВЛК-А, ВЛК-В, ВЛК-С, а также ВЛК-Т. Вирусы одной подгруппы препятствуют суперинфекции (явление интерференции) другим вирусом той же подгруппы, что связано с использованием трех различных рецепторов клеток хозяина подгруппами вируса и блокировании этих рецепторов в персистентно инфицированных клетках оболочечными гликопротеинами вируса. Основные рецепторы подгрупп А, В и С идентифицированы. Только ВЛК-А обладает инфекционными свойствами и передается горизонтально от кошки к кошке в естественных условиях. Подгруппы В и С образуются de novo у ВЛК-инфицированных кошек при помощи мутаций и рекомбинаций между геномом ВЛК-А и геномом клетки, а также генами эндогенных ретровирусов, которые могут содержаться в ДЕК кошки. Репликация ВЛК-В и ВЛК-С возможна только при участии ВЛК-А, так как часть генома, необходимая для репликации, у этих рекомбинантных вирусов отсутствует. Таким образом, ВЛК-А выполняет функцию вируса-помощника (Sarma P.S. et. al., 1978).
Тем не менее, в некоторых экспериментах репликация дефектных вирусов,осуществлялась без участия ВЛК-А. У новорожденных, свободных от патогенной микрофлоры котят (SPF), экспериментальная инфекция, вызванная ВЛК-В или ВЛК-С, наблюдалась без участия ВЛК-А (Bechtel М.К. et. al., 2006., Sarma P.S. et.- al., 1978). Однако в естественных условиях у инфицированных кошек выявляется либо только подгруппа А, либо ВЛК-А в комбинации с подгруппами В,.С, или обеими. Следовательно, устойчивость животного по отношению к подгруппе А вируса, означает устойчивость к ВЛК в целом. Патогенность подгрупп В и С выше, чем подгруппы A (Sarma P.S. et. al., 1978). Подгруппа В обычно связана со злокачественными новообразованиями. Подгруппа С встречается редко, главным образом она связана с нерегенеративной анемией (Pedersen N.C., 1988). Одновременное введение кошкам подгрупп А и В приводило к ослаблению инфекции по сравнению с инфекцией, вызванной только подгруппой A (Phipps A. J., 2000). Четвертая подгруппа - ВЛК-Т, является высоко цитопатогенной для Т лимфоцитов и способна индуцировать иммуносупрессию (Lauring A. S., et. al., 2001).