Разработка новых генетически кодируемых флуоресцентных кальциевых индикаторов для визуализации активности нейронов Барыкина Наталья Викторовна

Короткий опис

Барыкина, Наталья Викторовна.
Разработка новых генетически кодируемых флуоресцентных кальциевых индикаторов для визуализации активности нейронов : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10 / Барыкина Наталья Викторовна; [Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова]. - Москва, 2018. - 177 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат наук Барыкина Наталья Викторовна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Роль ионов кальция и кальциевый ток в нейронах
1.2. Кальций-связывающие белки
1.3. Кальциевые индикаторы
1.3.1. Химические кальциевые индикаторы
1.3.2. Генетически кодируемые кальциевые индикаторы
1.3.2.1. Генетически кодируемые кальциевые индикаторы на основе FRET
Индикаторы на основе белка кальмодулина
Индикаторы на основе белка тропонин С
1.3.2.2. Генетически кодируемые кальциевые индикаторы, состоящие из одного флуоресцентного белка
Семейства кальциевых индикаторов camgaroo и pericam
Семейство кальциевых индикаторов Case
Семейство GCaMP-подобных кальциевых индикаторов
Генетически кодируемые кальциевые индикаторы на основе одного флуоресцентного белка с испусканием в красной области спектра
1.3.2.3. Фотоконвертируемые и фотоактивируемые кальциевые индикаторы
GR-GECO
CaMPARI
1.3.2.4. Генетически кодируемые биолюминесцентные кальциевые индикаторы
1.3.2.5. Кальциевые индикаторы для мониторинга изменений концентрации ионов Са2+ в ЭР
Индикаторы на основе FRET
CatchER
CEPIA
GCaMPer
LAR-GECO
GAP - биолюминесцентный индикатор
1.4. Механизм действия генетически кодируемых кальциевых индикаторов
1.5. Сродство генетически кодируемых индикаторов к ионам Са2+, кинетика, динамический диапазон, селективность
1.6. Взаимодействие генетически кодируемых кальциевых индикаторов с белками клетки
1.7. Визуализация токов ионов Са2+ в беспозвоночных и рыбах in vivo
2+
1.8. Визуализация токов ионов Са в млекопитающих in vivo
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Амплификация фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле и очистка
2.2.2. Сайт-специфический мутагенез с помощью ПЦР с перекрывающимися фрагментами
2.2.3. Создание библиотек случайных мутантов
2.2.4. Трансформация бактериальных клеток
2.2.5. Скрининг библиотек
2.2.6. Очистка белков и их характеристика
2.2.6.1. Определение коэффициента экстинкции и квантового выхода
2.2.6.2. Определение констант диссоциации
2.2.6.3. Определение зависимости флуоресценции индикаторов от рН
2.2.6.4. Определение времени фотовыгорания
2.2.6.5. Определение времени созревания
2.2.6.6. Флуориметрия остановленного потока
2.2.7. Создание конструкций для временной трансфекции культур эукариотических клеток
2.2.8. Культивирование и трансфекция культур клеток
2.2.9. Наработка и выделение аденоассоциированных вирусных частиц
2.2.10. Флуоресцентная микроскопия
2.2.11. Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания
2.2.12. Выделение, трансдукция, трансфекция и визуализация нейрональных культур
2.2.13. Стимуляция нейрональных культур с помощью электрического поля
2.2.14. Электрофизиологические эксперименты
2.2.15. Временная экспрессия индикатора FGCaMP в эмбрионах рыб Danio rerio
2.2.16. Визуализация кальциевых токов в эмбрионах Danio rerio с помощью индикатора FGCaMP
2.2.17. Визуализация нейронов зрительной коры (V1), экспрессирующих кальциевый индикатор NTnC in vivo, с помощью двухфотонного микроскопа
2.2.18. Визуализация нейронов зрительной коры и гиппокампа, экспрессирующих кальциевые индикаторы NTnC и iYTnC2 in vivo, с помощью минимикроскопа nVista HD
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка генетически кодируемого кальциевого индикатора на основе тропонина C из Opsanus tau и флуоресцентного белка mNeonGreen
3.2. Характеристика кальциевого индикатора NTnC in vitro
3.3. Ответ кальциевого индикатора NTnC на добавление внешнего кальция к культуре клеток HeLa
3.4. Визуализация спонтанной активности в культуре нейронов с помощью кальциевого индикатора NTnC
3.5. Изучение электрофизиологических свойств кальциевого индикатора NTnC в диссоциированной культуре нейронов с помощью метода локальной фиксации потенциала
3.6. Визуализация активности нейронов зрительной коры бодрствующей мыши с помощью двухфотонной микроскопии и кальциевого индикатора NTnC
3.7. Визуализация нейронов зрительной коры, экспрессирующих кальциевый индикатор NTnC in vivo, с помощью минимикроскопа nVista
3.8. Разработка улучшенной версии NTnC-подобного кальциевого индикатора на основе желтого флуоресцентного белка
3.9. Характеристика кальциевого индикатора iYTnC2 in vitro
3.10. Ответ кальциевого индикатора iYTnC2 на добавление внешнего кальция к культуре клеток HeLa
3.11. Визуализация спонтанной активности в диссоциированной культуре нейронов с помощью кальциевого индикатора iYTnC2
3.12. Изучение электрофизиологических свойств кальциевого индикатора iYTnC2 в диссоциированной культуре нейронов с помощью метода локальной фиксации потенциала
3.13. Визуализация активности нейронов гиппокампа свободноподвижной мыши с помощью минимикроскопа nVista и кальциевого индикатора iYTnC2
3.14. Разработка генетически кодируемого кальциевого индикатора на основе кальмодулинов и киназ грибов
3.15. Характеристика кальциевого индикатора FGCaMP in vitro
3.16. Экспрессия кальциевого индикатора FGCaMP в культуре клеток HeLa
3.17. Визуализация спонтанной активности в культуре нейронов с помощью кальциевого индикатора FGCaMP
3.18. Изучение электрофизиологических свойств кальциевого индикатора FGCaMP в диссоциированной культуре нейронов с помощью метода локальной фиксации потенциала или с помощью внешнего электрического поля
3.19. Визуализация активности нейронов с помощью генетически кодируемого кальциевого индикатора FGCaMP в личинке Danio rerio in vivo
3.20. Анализ кристаллической структуры индикатора FGCaMP, структурно-направленная оптимизация его Са2+-связывающих доменов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ