Разработка технологии для идентификации вирусных агентов с использованием ДНК-метабаркодинга и высокопроизводительного секвенирования Мацвай Алина Дмитриевна

Короткий опис

Мацвай,АлинаДмитриевна.РазработкатехнологиидляидентификациивирусныхагентовсиспользованиемДНК-метабаркодингаивысокопроизводительногосеквенирования: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.03 /МацвайАлинаДмитриевна; [Место защиты: ФГАОУ ВО «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»]. - Москва, 2021. - 265 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
исследовательский университет)» На правах рукописи МАЦВАЙАЛИНАДМИТРИЕВНАРАЗРАБОТКАТЕХНОЛОГИИДЛЯИДЕНТИФИКАЦИИВИРУСНЫХАГЕНТОВСИСПОЛЬЗОВАНИЕМДНК-МЕТАБАРКОДИНГА ИВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГОСЕКВЕНИРОВАНИЯ03.01.03 Молекулярная биология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

стр. 11
Таким образом, требуется разработать альтернативный (модифицированный) подходдляобеспечения эффективного выявления и характеристикивирусныхнуклеиновых кислот. Целью работы являетсяразработкаметодикидляидентификациивирусныхагентовсиспользованиемДНК-метабаркодинга ивысокопроизводительногосеквенирования.Длядостижения этой цели ставились следующие задачи: 1. Разработать алгоритмдлядизайна...

стр. 31
и простая альтернатива метагеномике, хорошо работающая какдлясеквенированияотдельных генов, так идлянебольшихвирусныхгеномов [125]. Амплификация на основе ПЦР часто используетсядлясеквенированияполноговирусногогенома образцов с низкойвируснойнагрузкой [73], например, при расшифровки вспышки

Оглавление диссертациикандидат наук Мацвай Алина Дмитриевна
ВВЕДЕНИЕ
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
Глава 1. Аналитический обзор научно-технической литературы
1.1 Методы диагностики вирусных инфекций
1.1.1 Электронная микроскопия
1.1.2 Культуральный метод
1.1.3 Тест на фиксацию комплемента
1.1.4 Ингибирование гемагглютинации
1.1.5 Иммунологические методы
1.1.6 Методы, основанные на амплификации
1.1.7 Масс-спектрометрия
1.2 Исследование вирусных патогенов методами N08
1.2.1 Метагеномный подход
1.2.2 Проблемы метагеномного подхода
1.2.3 Методы улучшения результатов метагеномного секвенирования
1.2.4 Обогащение на основе гибридизации нуклеиновых кислот
1.2.5 Целевая ПЦР
1.2.6 ДНК-штрихкодирование
1.3 Определение вирусных патогенов в верхних дыхательных путях человека
1.3.1 Риновирусы и респираторные энтеровирусы
1.3.2 Парэховирусы
1.3.3 Респираторно-синцитиальный вирус человека (RSV)
1.3.4 Вирусы парагриппа
1.3.5 Вирус Кори
1.3.6 Метапневмовирусы
1.3.7 Вирусы гриппа
1.3.8 Коронавирусы
1.3.9 Аденовирусы
1.3.10 Бокавирус
1.3.11 Герпесвирусы
1.3.12 Анелловирусы
1.3.13 Полиомавирусы
1.4 Исследование вирусного разнообразия диких птиц
1.5 Заключение по разделу
Глава 2. Разработка биоинформатического алгоритма для дизайна структур праймеров и создание библиотек нуклеотидов для целевого обогащения нуклеиновых кислот вирусных патогенов в режиме мультиплекса
2.1 Получение референсных данных
2.2 Алгоритм, использующий множественные выравнивания референсных геномов
2.2.1 Описание алгоритма
2.2.2 Построение множественного выравнивания
2.2.3 Выбор консервативных участков
2.2.4 Выбор пар праймеров
2.2.5 Проверка совместимости
2.2.6 Проверка покрытия
2.3 Множественное выравнивание и разнообразие вирусов
2.4 К-мерный алгоритм с двойной кластеризацией и использованием матричного представления
2.4.1 Общая схема алгоритма
2.4.2 Блок генерации к-меров
2.4.3 Фильтрация к-меров
2.4.4 Вырождение к-меров
2.4.5 Картирование к-меров на референсную БД
2.4.6 Создание матрицы координат и файлов метаданных
2.4.7 Выбор олигонуклеотидов
2.4.8 Постфильтрация к-меров
2.5 Создание праймерных панелей для обогащения целевых групп вирусных патогенов
2.5.1 Праймерная панель для исследования вирома мигрирующих птиц
2.5.2 Праймерные панели для обогащения энтеровирусов
2.5.3 Праймерная панель для обогащения коронавирусов
2.5.4 Праймерная панель для обогащения вирусов, вызывающих респираторные заболевания
2.6 Заключение по разделу
Глава 3. Разработка методики проведения исследования и ее апробация
3.1 Отработка методик выделения вирусных нуклеиновых кислот из различных типов биологического материала на фоне высокого содержания ДНК "хозяина"
3.1.1 Источники вирусных НК
3.1.2 Контрольные образцы
3.1.3 Тестируемые методы выделения
3.1.4 Проведение амплификации
3.1.5 Результаты
3.1.6 Заключение по разделу
3.2 Тестирование праймерных панелей для целевого обогащения вирусов птиц, разработка методики одновременного анализа ДНК- и РНК-содержащих вирусов
3.2.1 Проведение целевой ПЦР
3.2.2 Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле
3.2.3 Смешивание и очистка ПЦР продукта
3.2.4 Измерение концентрации ампликонов
3.2.5 Приготовление NGS библиотек
3.2.6 Нормализация и пулирование
3.2.7 Оценка качества финальных пулов
3.2.8 Результаты экспериментов
3.3 Тестирование праймерных панелей для целевого обогащения вирусов рода Enterovirus
3.3.1 Отработка условий проведения амплификации целевых локусов
3.3.2 Очистка амплификатов, оценка концентрации ПЦР продуктов
3.3.3 Лигирование адаптеров
3.3.4 Индексация
3.3.5 Нормализация
3.3.6 Высокопроизводительное секвенирование
3.3.7 Результаты обработки данных секвенирования
3.4 Тестирование праймерных панелей для целевого обогащения вирусов семейства Coronaviridae
3.4.1 Отработка условий проведения амплификации целевых локусов
3.4.2 Очистка амплификатов, оценка концентрации ПЦР продуктов
3.4.3 Лигирование адаптеров
3.4.4 Индексация
3.4.5 Нормализация
3.4.6 Высокопроизводительное секвенирование
3.4.7 Результаты обработки данных секвенирования
3.5 Тестирование праймерной панели для обогащения респираторных вирусов,
вызывающих заболевания у человека
3.5.1 Контрольный материал
3.5.2 Отработка методики проведения целевой ПЦР
3.5.3 Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле
3.5.4 Очистка амплификатов, оценка концентрации ПЦР продуктов
3.5.5 Лигирование адаптеров
3.5.6 Индексация
3.5.7 Нормализация
3.5.8 Высокопроизводительное секвенирование
3.5.9 Результаты обработки данных секвенирования
3.6 Заключение по разделу
Глава 4. Исследование клинических образцов, полученных от пациентов с респираторными заболеваниями
4.1 Биологический материал
4.2 Пробоподготовка
4.3 Полученные результаты
4.4 Подтверждение полученных результатов
4.5 Заключение по разделу
Глава 5. Анализ вирома мигрирующих птиц околоводного комплекса
5.1 Биологический материал
5.2 Пробоподготовка
5.2.1 Выделение нуклеиновых кислот
5.2.2 Обратная транскрипция
5.2.3 Амплификация с праймерной панелью
5.2.4 Очистка амплификатов, оценка концентрации ПЦР продуктов
5.2.5 Оценка концентрации, нормализация, пулирование библиотек
5.2.6 Секвенирование
5.3 Результаты анализа данных
5.4 Исследование образца, содержащего нового представителя рода Atadenovirus
5.4.1 Проведение метагеномного секвенирования
5.4.2 Сборка генома de novo
5.4.3 Филогенетический анализ последовательностей генов
5.4.4 Оценка видовой принадлежности
5.5 Дополнительные исследования с использованием части библиотеки нуклеотидов.
Скрининг на заболевания, переносимые клещами и комарами (vector-borne viruses)
5.5.1 Описание биоматериала
5.5.2 Описание проведённого исследования
5.5.3 Полученные результаты
5.6 Заключение по разделу
Глава 6. Сравнение разработанного метода с аналогами
6.1 Описание методов сравнения
6.2 Описание эксперимента
6.3 Пробоподготовка
6.3.1 Вакуумная концентрация РНК-содержащих образцов
6.3.2 Фрагментация РНК
6.3.3 Синтез кДНК
6.3.4 Синтез второй цепи кДНК
6.3.5 Очистка продукта амплификации
6.3.6 Модификация 5" и 3" концов дцДНК
6.3.7 Лигирование универсального адаптера
6.3.8 Очистка продукта лигирования
6.3.9 Индексация библиотек
6.3.10 Очистка продукта амплификации
6.3.11 Измерение концентраций библиотек
6.3.12 Оценка качества библиотек после индексации, селекция длин
6.3.13 Реамплификация индексированных библиотек
6.3.14 Измерение концентраций библиотек
6.3.15 Оценка качества библиотек после индексации
6.3.16 Гибридизация
6.4 Результаты
6.4.1 Обогащение вируса гепатита В птиц
6.4.2 Обогащение авиаденовируса типа А
6.4.3 Обогащение атаденовируса (новый вид)
6.4.4 Обогащение гаммакоронавируса птиц
6.4.5 Обогащение вируса птичьего гриппа
6.4.6 Обогащение калицивируса
6.4.7 Обогащение астровируса
6.4.8 Обогащение ортореовируса птиц
6.4.9 Обогащение групп вирусов, не являющихся целевыми для разработанного метода
6.4.10 Исследование образцов, в которых с использованием разработанного метода не было выявлено нуклеиновых кислот патогенных для позвоночных вирусов
6.5 Заключение по разделу
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ