Сидор Роман Ігорович Імуномодуляторні ефекти опіоїдних та нестероїдних анальгетиків при хірургічному видален­ні пухлини

Короткий опис

Сидор Роман Ігорович, фахівець з біотехнології Науково­го центру ТОВ «Юрія-Фарм»: «Імуномодуляторні ефекти опіоїдних та нестероїдних анальгетиків при хірургічному видален­ні пухлини» (03.00.09 - імунологія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевчен­ка

Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
На правах рукопису
СИДОР РОМАН ІГОРОВИЧ
УДК 616-006/-08:57.04
ІМУНОМОДУЛЯТОРНІ ЕФЕКТИ ОПІОЇДНИХ ТА НЕСТЕРОЇДНИХ
АНАЛЬГЕТИКІВ ПРИ ХІРУРГІЧНОМУ ВИДАЛЕННІ ПУХЛИНИ
03.00.09 – імунологія
Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Науковий керівник:
доктор біологічних наук
Сківка Лариса Михайлівна
Київ – 2017
2
ЗМІСТ
Список умовних скорочень……………………………………………….….. 5
ВСТУП………………………………………………………………………..... 7
РОЗДІЛ 1. Огляд літератури. ………………………………………………... 13
1.1. Периопераційна імуносупресія при хірургічному видаленні пухлини..
1.2. Опіоїдні анальгетики………...……………………………….………...…
1.2.1. Загальна характеристика опіатів та їх рецепторів…….………...…….
1.2.2. Вплив опіатів на імунну систему…….……………….………………..
1.3. Нестероїдні протизапальні препарати……….………………………..…
1.3.1. Роль простагландину Е2 та циклооксигенази 2 типу в регуляції
імунної відповіді …………………….………………………………….…..
1.3.2. Застосування нестероїдних протизапальних препаратів в
онкології………….……………………………………….…………….…...
13
19
19
21
26
26
29
РОЗДІЛ 2. ОБ’ЄКТИ, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ……….. 32
2.1. Тварини, пухлинні клітинні лінії та фармакологічні препарати, що
були використані для дослідження ………………………………..…………
2.2. Схема проведення експерименту із хірургічним видаленням
первинної пухлини. …………………………………………………...………
2.3. Оцінка кількості та об’єму метастатичних вузлів у легенях мишей з
перещепленою пухлиною……………………………………………………..
2.4. Імунологічні методи досліджень………………………………………...
2.4.1. Визначення клітинності селезінки піддослідних тварин………….
2.4.2. Оцінка ендоцитарної активності фагоцитів різної локалізації…...
2.4.3. Визначення цитотоксичної активності спленоцитів……………….
2.4.4. Визначення проліферативної активності лімфоцитів селезінки
під дією мітогенів……………………….………………………………….
2.5. Молекулярно-генетичні методи досліджень……………………………
2.5.1. Забір та зберігання біологічного матеріалу для молекулярно32
33
35
35
35
36
37
38
40
3
генетичних досліджень……………………………………………..………
2.5.2. Метод кислотно-фенольної екстракції РНК………………………..
2.5.3. Дослідження рівня експресії генів цитокінів та транскрипційного
фактору FoxP3………………………………………………………………
2.6. Методи дослідження впливу нестероїдних та опіоїдних анальгетиків
на стан імунної системи хворих на рак нирки у периопераційному періоді
2.6.1 Характеристика хворих на рак нирки та схема застосування
анальгетиків ………..……………………………………………………….
2.6.2 Виділення та підрахунок мононуклеарних лейкоцитів
периферичної крові ……………...…………………………………………
2.6.3 Оцінка цитотоксичної активності лейкоцитів периферичної крові..
2.6.4. Дослідження проліферативної активності лімфоцитів
периферичної крові …...……………………………………………………
2.6.5 Дослідження популяційного складу лімфоцитів
периферичної крові . …...…………………………………………………..
2.6.6 Визначення внутрішньоклітинного рівня ІFN-γ …………………...
2.7 Статистичні методи ……………………………………………………….
40
40
41
43
43
43
46
47
48
49
51
РОЗДІЛ 3. Дослідження впливу опіоїдних та нестероїдних анальгетиків
на стан імунної системи та виживаність у мишей С57Bl/6 після
видалення первинної пухлини …………………………………………..…..
52
53
3.1 Вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на пухлинний ріст та
виживаність у мишей С57Bl/6 після видалення первинної
пухлини…………………………………..…………………………………….
3.2 Вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на ендоцитарну
активність фагоцитів різної локалізації після видалення первинної
пухлини ……………………………………..…………………………………
3.2.1 Ендоцитарна активність гранулоцитів крові та селезінки …………
3.2.2 Ендоцитарна активність моноцитів крові та селезінки …………….
3.2.3 Ендоцитарна активність перитонеальних макрофагів………………
3.3. Вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на проліферативну
53
56
57
60
62
4
активність спленоцитів………………………………………………………..
3.4. Вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на цитотоксичну
активність спленоцитів………………………………………………………..
3.5. Вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на рівень експресії
генів цитокінів клітинами селезінки та лімфатичних вузлів……………….
3.5.1. Вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на рівень
експресії генів INF-γ та IL-4 в клітинах селезінки та сторожових
лімфатичних вузлів .………………………………………………………..
3.5.2. Вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на рівень
експресії генів IL-10 та TGF-β в клітинах селезінки та сторожових
лімфатичних вузлів…………………………………………………………
3.6. Вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на рівень експресії
транскрипційного фактору FoxP3 клітинами селезінки та лімфатичних
вузлів……………………………………………………………………………
64
69
72
72
76
79
РОЗДІЛ 4. Вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на стан імунної
системи хворих на рак нирки у периопераційному періоді………...………
4.1. Гематологічні показники хворих на рак нирки у периопераційному
періоді ………………………………………………………………………….
4.2. Ефективність периопераційного знеболення у хворих на рак нирки
при застосуванні опіоїдної та нестероїдної аналгезії ……………………..
4.3. Проліферативна активність мононуклеарних клітин периферичної
крові ……………………………………………………………………………
4.4. Популяційний склад лімфоцитів та моноцитів периферичної крові….
4.5. Вплив опіоїдної та нестероїдної аналгезії на функціональну
активність Т лімфоцитів та природних кілерних клітин……………………
83
83
84
88
92
97
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ…………………………………………….. 101
ВИСНОВКИ…………………………………………………………………… 118
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ…………………………………….. 120
5
СПИСОК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АПК – антигенпрезентуючі клітини
ДНК – дезоксирибонуклеїнова кислота
ЕДТА – етилендіамінтетраоцтова кислота
ЕТС – ембріональна теляча сироватка
ЗФР – забуферений фізіологічний розчин
ІПА – індекс проліферативної активності
КЛЛ – карцинома легені Льюіс
МКАт – моноклональні антитіла
МНЛПК – мононуклеарні лейкоцити периферичної крові
МОР – μ-опіоїдні рецептори
НПЗП – нестероїдні протизапальні препарати
ПГЕ-2 – простагландин Е 2
ПКК – природні кілерні клітини
ПЛР – полімеразно-ланцюгова реакція
РБТЛ – реакція бласттрансформації лімфоцитів
РН –рак нирки
РНК – рибонуклеїнова кислота
Т-рег – регуляторні Т лімфоцити
Тх – Т лімфоцити хелпери
ФГА - фітогемаглютинін
ФМА – форболмірістатацетат
ЦА – цитотоксична активність
6
ЦОГ-2 – циклооксигеназа 2 типу
ЦТЛ – цитотоксичні Т лімфоцити
CD – cluster of differentiation – кластер диференціації
FITC – fluorescein isothyocyanate – флюоресцеїна ізотіоціанат
GAPDH – glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase – гліцеральдегід-3-
IFN-γ – interferon γ – інтерферон γ
IL – interleukin – інтерлейкін
MDSC – myeloid-derived suppressor cells – cупресорні клітини мієлоїдного
походження
MHC – major histocompatibility complex – головний комплекс гістосумісності
PI – propidium iodide – пропідій йодид
TGF-β – transforming growth factor β – трансформуючий фактор росту β
7
ВСТУП
Актуальність. Злоякісні новоутворення складають значну частку в
структурі захворюваності населення як в Україні, так і в усьому світі.
Основною причиною смертності при онкологічних захворюваннях є розвиток
рецидивів та метастазів після проведення основного лікування, що пов’язано
із неможливістю повністю елімінувати пухлинні клітини за допомогою
консервативних методів лікування.
Не зважаючи на сучасні досягнення хіміотерапії, променевої терапії та
біотерапії, хірургічне видалення пухлини залишається основним
терапевтичним підходом у лікуванні більшості нозологічних форм раку [1].
Провідним чинником, що обумовлює адекватну реабілітацію після
хірургічної операції, є повноцінність функціонування імунної системи
організму, особливо при оперативному втручанні у онкологічних хворих,
оскільки саме імунна система відіграє ключову роль в елімінації
дисемінованих пухлинних клітин. На сьогодні не викликає сумніву той факт,
що імунна система онкологічних хворих часто скомпрометована
супресорним впливом з боку пухлини, що сприяє уникненню злоякісними
клітинами імунного нагляду [2]. Разом з тим, хірургічна травма здатна
негативно впливати на функцію імунної системи, поглиблюючи стан
імуносупресії та збільшуючи тим самим ризик розвитку рецидивів і
метастазів. Окрім пошкодження тканин та болю, до периопераційних
стресових факторів з негативним впливом на імунну реактивність організму
також відносять крововтрату, гемотрансфузії, вплив препаратів для анестезії
та знеболення [3]. Мінімізація негативного впливу цих чинників є сьогодні
важливим завданням в онкохірургії.
Останнім часом активно досліджується вклад опіоїдних анальгетиків, які
широко застосовуються для знеболення при видаленні пухлини, у розвиток
периопераційної імуносупресії. На сьогодні встановлено, що опіоїдні
8
рецептори експресуються не лише на клітинах нервової системи, де вони
опосередковують аналгезуючий ефект, а й на клітинах імунної системи –
моноцитах, дендритних клітинах, Т- і B-клітинах [4, 5], що робить їх
чутливими до дії опіатів. Крім того, можливий їх опосередкований вплив на
імунну систему через нейро-гуморальні механізми [6]. В низці досліджень
показано, що опіоїдні пептиди здатні негативно впливати на імунну систему,
пригнічуючи функції макрофагів, природних кілерів та Т клітин [4, 7]. Крім
того, на деяких експериментальних пухлинних моделях показано здатність
опіоїдів стимулювати ангіогенез та проліферацію пухлинних клітин. Клінічні
дані стосовно впливу опіоїдної аналгезії на ризик розвитку метастазів та
післяопераційних ускладнень на сьогодні є нечисленними і суперечливими.
Наразі активно обговорюється питання щодо зменшення застосування
опіоїдних препаратів для знеболення при хірургічному втручанні у
онкологічних хворих.
Нестероїдні протизапальні препарати розглядаються на сьогодні як
можлива альтернатива використанню опіатів у периопераційній аналгезії. До
цих препаратів належать селективні та неселективні інгібітори
циклооксигенази 2 типу (ЦОГ-2), яка бере участь у синтезі простагландину
Е2 (ПГЕ2). ПГЕ2 залучений не лише у формуванні больової відповіді та
процесі запалення, а також виступає одним із ключових медіаторів
пухлиноасоційованої імуносупресії [8, 9]. Виходячи з цього, застосування
нестероїдних анальгетиків в онкохірургії видається особливо перспективним.
Разом з тим, вплив інгібіторів ЦОГ-2 на стан імунної системи в умовах
хірургічного видалення пухлини є практично не дослідженим.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконана в межах технічного завдання держбюджетної
теми № 11БФ036-01 «Механізми реалізації адаптаційно-компенсаторних
реакцій організму за умов розвитку різних патологій» кафедри мікробіології
та загальної імунології ННЦ «Інститут біології» Київського національного
університету імені Тараса Шевченка, 2011-2015 рр.
9
Частину досліджень на пухлинних моделях та клінічні дослідження було
проведено в науково-дослідній лабораторії експериментальної онкології
Національного інституту раку під керівництвом к. б. н., ст. н. с.
Храновської Н. М., при співпраці з науково-дослідним відділенням
анестезіології та інтенсивної терапії, а також науково-дослідним відділенням
пластичної та реконструктивної онкоурології Національного інституту раку.
Мета роботи: дослідити вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків
на стан імунної системи у периопераційному періоді при хірургічному
видаленні пухлини.
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
1. Оцінити вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на пухлинний
ріст та виживаність у мишей після видалення первинного пухлинного
вузла перещеплюваної карциноми легені Льюїс.
2. Дослідити вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на ендоцитарну
активність фагоцитів різної локалізації у мишей С57Bl/6 після видалення
первинного пухлинного вузла перещеплюваної карциноми легені Льюїс.
3. Провести дослідження впливу опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на
цитотоксичну активність спленоцитів мишей після видалення
первинного пухлинного вузла.
4. Дослідити вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на
проліферативну активність спленоцитів після видалення первинного
пухлинного вузла.
5. Визначити рівні експресії генів цитокінів IFNγ, IL-4, TGF-β, IL-10 та
транскрипційного фактору FoxP3 в клітинах селезінки та лімфатичних
вузлів мишей.
6. Дослідити вплив опіоїдних та нестероїдних анальгетиків на імунну
реактивність хворих на рак нирки у периопераційному періоді.
Об’єкт дослідження: імуномодуляторна активність опіоїдних та
нестероїдних анальгетиків при периопераційному знеболенні в умовах
хірургічного видалення пухлини.
10
Предмет дослідження: фенотипові та функціональні властивості клітин
імунної системи у периопераційному періоді при застосуванні знеболення
опіоїдними та нестероїдними анальгетиками.
Методи дослідження: для виконання поставлених завдань у роботі
використано методи експериментальної онкології, імунологічні,
цитофлуориметричні, молекулярно-генетичні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на
експериментальній моделі хірургічного видалення первинної пухлини
охарактеризовано вплив периопераційного знеболення опіоїдними та
нестероїдними анальгетиками на стан імунної системи у мишей C57Bl/6.
Встановлено, що застосування як селективного, так і неселективного
інгібіторів циклооксигенази-2 сприяє підтриманню фагоцитарної активності
гранулоцитів та моноцитів периферійної крові та селезінки у
післяопераційному періоді на вищому рівні в порівнянні із використанням
опіоїдних пептидів.
Розширено існуючі уявлення щодо негативного впливу опіоїдних
пептидів на імунну реактивність при хірургічному видаленні первинної
пухлини. Показано, що при опіоїдній аналгезії в сторожових лімфовузлах
значно зростає рівень експресії генів TGF-β та FoxP3, які є маркерами Трегуляторних клітин, а також відбувається посилення експресії генів
цитокінів Тх2 типу – IL-4 та IL-10 з негативним впливом на протипухлинну
резистентність організму.
Отримано нові дані стосовно позитивного імуномодуляторного впливу
нестероїдних анальгетиків у периопераційному періоді. Доведено, що
застосування нестероїдних протизапальних препаратів у пацієнтів з раком
нирки сприяє збереженню активності клітинної ланки імунної відповіді після
хірургічної операції, що проявлялось зростанням кількості IFNγ+
Т
лімфоцитів та вищою кількістю і цитотоксичною активністю природних
кілерних клітин.
11
Практичне значення одержаних результатів.
Одержані результати експериментально обґрунтовують доцільність
розробки нових схем знеболення в онкохірургії із застосуванням інгібіторів
циклооксигенази 2 типу та зменшенням використання опіоїдних
анальгетиків, що може бути перспективним підходом для зниження проявів
периопераційної імуносупресії та ризику розвитку метастазів у онкологічних
хворих.
Матеріали дисертаційної роботи використовуються в учбовому процесі
кафедри мікробіології та загальної імунології ННЦ «Інститут біології» (у
структурі курсу лекцій «Імуномодуляторні препарати» для студентів
імунологів).
Особистий внесок здобувача. Спільно з науковим керівником д.б.н.,
Л.М. Сківкою та к.б.н., ст.н.с. Н.М. Храновською розроблено концепцію
дисертаційної роботи, поставлені мета та завдання дисертаційного
дослідження. Автором самостійно були проаналізовані літературні дані
стосовно проблематики дисертаційної роботи. Здобувачем проведені
дослідження для визначення впливу периопераційного знеболення
опіоїдними та нестероїдними анальгетиками на експериментальній моделі
хірургічного видалення первинної пухлини. Автором виконані
цитофлуориметричні дослідження кількісних та функціональних показників
стану імунної системи експериментальних тварин, змін популяційного і
субпопуляційного складу лімфоцитів периферичної крові онкологічних
пацієнтів, а також виділення РНК з біологічного матеріалу та проведення
ПЛР для визначення рівня експресії генів цитокінів та транскрипційного
фактору FoxP3. Автором проведено аналіз, здійснено статистичну обробку та
теоретичне узагальнення отриманих результатів дослідження, сформульовані
основні положення і висновки роботи. Обговорення отриманих результатів
проводили спільно з науковим керівником та к.б.н., ст.н.с. Н.М.
Храновською.
12
Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи
були представлені на науково-практичній конференції молодих вчених
«Інновації діагностики і лікування хворих на злоякісні пухлини» (Київ, 2014),
міжнародному медичному конгресі «Впровадження досягнень сучасної
медичної науки в практику охорони здоров’я України» (Київ, 2015), науковопрактичній конференції молодих вчених з міжнародною участю «Сучасна
онкологія: діагностика та лікування» (Київ, 2015), 4-у Європейському
конгресі з імунології «ЕСІ-2015» (Відень, Австрія, 2015), 18-й Міжнародній
літній школі з імунології «Immune System: Genes, Receptors and Regulation»
(Рабац, Хорватія, 2015), VII-й Конференнції з міжнародною участю
«Перспективи діагностики та лікування онкологічної патології» (Київ, 2016),
ІІ-й міжнародній науковій конференції «Мікробіологія та імунологія –
перспективи розвитку в ХХІ сторіччі» (Київ, 2016), 23-у міжнародному
студентському конгресі з біомедичних наук «ISCOMS-2016» (Грьонінген,
Нідерланди, 2016).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 робіт, з них 5
статей у вітчизняних фахових наукових виданнях ( з них 1 – у виданнях, що
входять до міжнародної бази даних SCOPUS; 2 – у виданнях, що входять до
міжнародної бази даних Copernicus), 11 тез у матеріалах міжнародних та
вітчизняних конгресів і конференцій.
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі
вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, двох
розділів результатів дослідження та їх обговорення, висновків та списку
використаних літературних джерел. Робота викладена на 139 сторінках,
ілюстрована 3 таблицями та 28 рисунками. Перелік використаних
літературних джерел складається зі 181 найменування, з них кирилицею – 5,
латиницею – 176.

Список літератури

ВИСНОВКИ
Розвиток рецидивів та метастазів, який пов’язаний із наявністю
мінімальної залишкової хвороби після видалення первинної пухлини, є
основною причиною смертності при онкологічних патологіях. Імунна
система відіграє ключову роль у елімінації дисемінованих пухлинних клітин,
проте у периопераціному періоді зазнає супресорного впливу стресових
чинників, таких як хірургічна травма, біль та вплив опіоїдних препаратів, які
є основою всіх схем знеболення в онкохірургії. Мінімізація впливу
периопераційної імуносупресії, зокрема за рахунок розробки альтернативних
схем анальгезії, є важливим завданням сучасної онкології. Перспективним у
цьому напрямку є дослідження нестероїдних анальгетиків, що є інгібіторами
циклооксигенази 2 типу – ферменту, залученого у формування як
пухлиноасоційованої, так і периопераційної імуносупресії.
1. Застосування нестероїдних анальгетиків декскетопрофену та парекоксибу
у периопераційному періоді збільшує тривалість життя мишей лінії
C57Bl/6 після хірургічного видалення первинної пухлини порівняно із
застосуванням омнопону.
2. Периопераційне знеболення нестероїдними анальгетиками, на відміну від
опіоїдної анальгезії запобігає зниженню кількості поліморфноядерних та
мононуклеарних фагоцитів крові та селезінки мишей та сприяє зростанню
їх ендоцитарної активності після хірургічного видалення первинної
пухлини (при застосуванні декскетопрофену та парекоксибу індекси
фагоцитарної активності гранулоцитів селезінки зростають вдвічі, а
циркулюючих моноцитів в два та в три рази, відповідно).
3. При аналгезії нестероїдними протизапальними препаратами індекс
спонтанної проліферативної активності спленоцитів мишей після
хірургічного видалення первинної пухлини перевищував значення при
аналгезії омнопоном на 39,5 % для парекоксибу та на 75,8 % для
120
декскетопрофену, а мітоген-стимульована проліферація була вищою у 1,5
та 2 рази, відповідно.
4. Цитотоксична активність природних кілерних клітин на третю добу після
операції у тварин, яким застосовували нестероїдні анальгетики, була
вищою порівняно із тими, яким проводили опіоїдну аналгезію
((62,2 ± 2,4) % та (59,6 ± 2,9) % у групах декскетопрофену та парекксибу
проти (50,2±3,2) % у групі омнопону).
5. Анальгезія декскетопрофеном приводить до зростання рівня мРНК IFN-γ
в 1,6 разів у селезінці та в 2 рази у сторожових лімфовузлах мишей лінії
C57Bl/6 після хірургічного видалення первинної пухлини, тоді як
застосування омнопону спричиняє зростання у сторожових лімфовузлах
рівня експресії супресорних цитокінів (IL-10 в 1,7 разів, IL-4 в 6 разів та
TGF-β у 8 разів порівняно із значеннями до операції).
6. Застосування опіоїдного анальгетику омнопону приводить до значного
зростання у сторожових лімфовузлах тварни рівня мРНК
транскрипційного фактору FoxP3, який на третю добу після операції
перевищував відповідні значення тварин, яким вводили декскетопрофен
та парекоксиб у 1,7 разів та 2,2 разів, відповідно.
7. У хворих на рак нирки периопераційне знеболення із використанням
нестероїдних анальгетиків забезпечує підтримання вищої активності
клітинної ланки імунної системи у післяопераційному періоді, ніж при
знеболенні опіатами, про що свідчить в двічі вища кількість
циркулюючих INF-γ
+
Т клітин, вищі показники кількості природних
кілерних клітин та їх цитотоксичної активності ((13,92 ± 2,26) % та
(15,06 ± 1,72) % у групах декскетопрофену та парекоксибу порівняно із
(9,42 ± 1,18) % при застосуванні омнопону).