Тіхова Єлизавета Володимирівна Біохімічні показники розвитку експериментально­го остеоартрозу щурів

Короткий опис

Тіхова Єлизавета Володимирівна, тимчасово не пра­цює: «Біохімічні показники розвитку експериментально­го остеоартрозу щурів» (03.00.04 - біохімія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Кваліфікаційна наукова
праця правах рукопису
ТІХОВА ЄЛИЗАВЕТА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 616.7:615.2/.3:577.125.8
ДИСЕРТАЦІЯ
БІОХІМІЧНІ ПОКАЗНИКИ РОЗВИТКУ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО
ОСТЕОАРТРОЗУ ЩУРІВ
03.00.04 – біохімія
09 - Біологія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело.
_______________Є.В. Тіхова
Науковий керівник: Дворщенко Катерина Олександрівна, д. б. н., с. н. с.
Київ – 2018

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ........................................................ 12
ВСТУП............................................................................................................. 14
РОЗДІЛ 1. Огляд літератури........................................................................ 20
1.1. Етіологія та патогенез остеоартрозів.............................................. 20
1.2. Біохімічні зміни у суглобі за умов розвитку остеоартрозу.......... 23
1.3. Сучасні підходи лікування та профілактики остеоартрозів......... 28
РОЗДІЛ 2. Матеріали та методи досліджень……...............................… 36
2.1. Використані матеріали та реактиви................................................ 36
2.2. Умови проведення експерименту.................................................... 37
2.3. Гістологічний аналіз зрізів гіалінового хряща колінних суглобів
щурів.................................................................................................. 38
2.4. Отримання гомогенату хрящової тканини...................................... 39
2.5. Отримання сироватки крові щурів................................................... 40
2.6. Визначення вмісту цитокінів та факторів росту у хрящовій
тканині урів......................................................................................... 40
2.7. Визначення концентрації простагландину Е2 в сироватці крові... 41
2.8. Визначення концентрації молекул низької та середньої
молекулярної маси у сироватці крові.............................................. 42
2.9. Визначення вмісту супероксидного радикалу в сироватці крові та
хрящовій тканині.............................................................................. 42
2.10. Визначення ксантиноксидазної активності в сироватці крові та
хрящовій тканині............................................................................... 43
2.11. Визначення вмісту пероксиду водню в сироватці крові та
хрящовій тканині............................................................................... 44
9
2.12. Визначення вмісту дієнових кон’югатів та шиффових основ
ненасичених жирних кислот в сироватці крові та хрящовій
тканині................................................................................................ 45
2.13. Визначення вмісту ТБК-активних продуктів в сироватці крові та
хрящовій тканині………….............................................................. 46
2.14. Визначення вмісту продуктів окисної модифікації білків в
сироватці крові та хрящовій тканині …..……………………….. 46
2.15. Визначення вмісту загальних, білок-зв’язаних та небілкових
SH-груп в сироватці крові та хрящовій тканині........................... 47
2.16. Визначення каталазної активності в сироватці крові та хрящовій
тканині............................................................................................... 48
2.17. Визначення супероксиддисмутазної активності в сироватці крові
та хрящовій тканині.......................................................................... 49
2.18. Визначення глутатіонпероксидазної активності в сироватці крові
та хрящовій тканині.......................................................................... 50
2.19. Визначення глутатіонтрансферазної активності в сироватці крові
та хрящовій тканині.......................................................................... 50
2.20. Визначення глутатіонредуктазної активності в сироватці крові
та хрящовій тканині.......................................................................... 50
2.21. Визначення вмісту відновленого та окисленого глутатіону в
сироватці крові та хрящовій тканині............................................... 51
2.22. Визначення концентрації білка за методом Лоурі.......................... 52
2.23. Кількісна ЗT-ПЛР............................................................................... 52
2.23.1. Виділення загальної РНК з хрящів щурів.......................... 52
2.23.2. Оцінка рівня експресії генів................................................ 53
2.24. Статистична обробка отриманих результатів................................. 54
10
РОЗДІЛ 3. Результати досліджень та їх обговорення.............................. 55
3.1. Оцінка ступеню запалення у щурів за умов монойодацетатіндукованого остеоартрозу та при дії хондропротектора……….. 55
3.1.1. Морфометричні параметри колінного суглобу.................. 55
3.1.2. Гістологічний аналіз тканини колінного суглобу.............. 58
3.1.3. Концентрація цитокінів у сироватці крові
(ІЛ-1β, ФНП-α, ІЛ-12Вр40, ІЛ-4, ІЛ-10)............................. 61
3.1.4. Концентрація простагландина Е2 у сироватці крові……. 68
3.1.5. Рівень молекул низької та середньої молекулярної маси
у сироватці крові................................................................... 71
3.1.6. Рівень експресії мРНК генів Ptgs2 (COX-2), Nos2, Tgfb1
у хрящовій тканині суглобу.................................................. 74
3.2. Інтенсивність вільнорадикальних процесів у сироватці крові та
хрящовій тканині щурів при експериментальному остеоартрозі та
при дії хондропротектора................................................................. 84
3.2.1. Вміст активних форм кисню у сироватці крові та хрящовій
тканині щурів......................................................................... 84
3.2.2. Ксантиноксидазна активність у хрящовій тканині колінних
суглобів щурів....................................................................... 87
3.2.3. Вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів у сироватці
крові та хрящовій тканині щурів.......................................... 89
3.2.4. Вміст продуктів окисної модифікації білків у сироватці
крові та хрящовій тканині щурів........................................... 94
3.2.5. Ферменти антирадикального захисту в сироватці крові та
хрящовій тканині щурів........................................................ 99
3.2.6. Глутатіонова антиоксидантна система в сироватці крові та
хрящовій тканині щурів........................................................ 102
3.2.7. Вміст загальних, білок-зв’язаних та небілкових SH-груп у
сироватці крові та хрящовій тканині щурів........................ 110
11
3.3. Показники структурної будови хрящової тканини у щурів за
умов експериментального остеоартрозу та при дії
хондропротектора:……………………………………………….. 115
3.3.1. Рівень експресії мРНК гену Col2a1
(колаген тип II альфа1) ……………………………….…. 115
3.3.2. Рівень експресії мРНК гену Acan (аггрекану)…………. 118
РОЗДІЛ 4. УЗАГАЛЬНЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ.......... 121
ВИСНОВКИ.................................................................................................. 132
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ.................................................. 134
Додаток 1…………………………………………...………………………. 166

Список літератури

ВИСНОВКИ
Отримані результати дослідження доповнюють існуючі на сьогодні
уявлення щодо біохімічних механізмів розвитку пошкодження хрящової тканини
колінного суглобу щурів за умов монойодацетат-індукованого остеоартрозу.
Показано важливу роль окисного стресу у формуванні дегенеративнодистрофічних змін у суглобі. Виявлено, що хондропротектор на основі
хондроїтина сульфату проявляє антизапальну та антиоксидантну дію на організм
щурів при монойодацетат-індукованому остеоартрозі.
1. Виявлено ознаки запалення із помірною лейкоцитарною інфільтрацією
колінних суглобів щурів та показано зростання рівня молекул низької та
середньої молекулярної маси, концентрації медіаторів запалення (ІЛ-1β, ФНП-α,
простагландину Е2) при одночасному зростанні рівня протизапального цитокіну
ІЛ-10 у сироватці крові та збільшення рівня експресії генів, залучених до
розвитку запалення (Ptgs2, Nos2, Tgfb1) у хрящовій тканині щурів при
монойодацетат-індукованому остеоартрозі.
2. Показано інтенсифікацію вільнорадикальних процесів, а саме зростання
вмісту супероксидного радикалу, перекису водню, продуктів перекисного
окиснення ліпідів (дієнових кон’югатів, ТБК-активних сполук, шиффових основ)
та окисної модифікації білків на фоні підвищення ксантиноксидазної активності
у хрящовій тканині та сироватці крові щурів за умов остеоартрозу.
3. Виявлено порушення антиоксидантної системи у хрящовій тканині та в
сироватці крові щурів при експериментальному остеоартрозі, а саме, в хрящовій
тканині виявлено зростання супероксиддисмутазної та каталазної активностей в
4 та в 4,7 раза на фоні виснаження глутатіон-залежної ланки антиоксидантного
захисту; в сироватці крові спотерігалося зниження супероксиддисмутазної
активності в 1,6 раза та зростання каталазної активності в 1,6 раза на фоні
пригнічення активності глутатіонової системи.
133
4. Показано зниження рівня експресії генів, що відповідають за будову
хрящової тканини за умов остеоартрозу, а саме Col2a1 – в 4,1 раза та Acan – в 2
рази порівняно з контролем.
5. Виявлено, що введення хондропротекторного препарату на основі
хондроїтина сульфату призводить до зниження запалення, відновлення окисноантиоксидантної рівноваги та регенерації хрящової тканини колінного суглобу
щурів при монойодацетат-індукованому остеоартрозі.