Влияние аминокислот, природных и синтетических пептидов на культуру ткани кожи молодых и старых крыс Войцеховская, Марина Александровна

Короткий опис

Войцеховская, Марина Александровна. Влияние аминокислот, природных и синтетических пептидов на культуру ткани кожи молодых и старых крыс : диссертация ... кандидата медицинских наук : 14.01.30 / Войцеховская Марина Александровна; [Место защиты: Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения РАМН].- Санкт-Петербург, 2011.- 83 с.: ил.
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИкандидат медицинских наук Войцеховская, Марина Александровна
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ.
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Структурно-функциональные особенности развития ткани кожи в онтогенезе.
1.2. Теории старения клеток и тканей.
1.3. Изменения кожи при старении организма.
1.4. Роль биорегуляторных пептидов в функционировании клеток и тканей.
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Состав питательной среды.
2.2. Получение коллагена и коллагеновой подложки.
2.3. Выделение тканей.
2.4. Морфологические и морфометрические методы исследования развития эксплантатов в органотипической культуре тканей
2.5. Препараты, исследованные в культуре тканей.
2.6. Определение эффективной концентрации аминокислот и пептидов в органотипической культуре ткани.
2.7. Иммуноцитохимические методы исследования эксплантатов
2.8. Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений.
2.9. Статистическая обработка экспериментальных данных.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Влияние аминокислот на культуру ткани кожи молодых и старых крыс.
3.2. Исследование процессов пролиферации и апоптоза при действии аминокислот в эксплантатах кожи молодых и старых крыс.
3.3. Исследование влияния дипептидов на развитие эксплантатов кожи молодых и старых крыс.
3.4. Исследование процессов пролиферации и апоптоза при действии дипептидов в эксплантатах кожи молодых и старых крыс.
3.5. Исследование влияния трипептидов на развитие эксплантатов кожи молодых и старых крыс.
3.6. Исследование влияния тетрапептидов на развитие эксплантатов кожи молодых и старых крыс.
3.7. Исследование процессов пролиферации и апоптоза при действии тетрапептидов в эксплантатах кожи молодых и старых крыс.
3.8. Исследование влияния природных полипептидов на развитие эксплантатов кожи молодых и старых крыс.
3.9. Исследование процессов пролиферации и апоптоза при действии природных полипептидов в эксплантатах кожи молодых и старых крыс.
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
ВЫВОТТЪТ

Список літератури

Введение к работе
Прогрессирующее увеличение доли пожилых и старых людей в общей численности населения вместе с сокращением рождаемости в последнее время становится всё более актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой развитых стран [Анисимов В.Н., 2007]. Одними из первых проявлений процесса старения являются дегенеративные изменения в коже, которая, выполняя барьерную функции, подвергается не только возрастным изменениям, но и испытывает локальный стресс, обусловленный повреждающими факторами внешней среды. В результате запущенной программы старения в клетках кожи (как и в клетках всего организма) неотвратимо происходят существенные изменения: уменьшается их митотическая активность, постепенно нарушаются синтетические процессы, накапливаются модифицированные белки, происходит повреждение мембран клеток, ДНК и ферментов. В организме поддержание биологической целостности регулируется на клеточном уровне сигналами, которые позволяют сохранять равновесное состояние между основными физиологическими процессами - пролиферацией и апоптозом. Многие пептиды принимают участие в сигнальной трансдукции между различными типами клеток. Кроме того, биорегуляторные пептиды, содержащиеся практически во всех тканях организма, выполняют не только сигнальную роль, но и непосредственно участвуют в регуляции физиологических процессов, начиная от отдельных функций специализированных клеток и заканчивая сложными поведенческими актами [Хавинсон В.Х. и др., 2002]. Биорегуляторные пептиды впервые были выделены В.Г.Морозовым и В.Х. Хавинсоном в 1971 г. из гипоталамической области мозга и тимуса [Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 1982; Морозов В.Г. и др., 2000; Коркушко О.В. и др., 2002; Хавинсон В.Х. и др., 2002; Рыжак Г.А. и др., 2004]. Затем в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии были синтезированы новые ди-, три- и тетрапептиды, являющиеся аналогами эндогенных пептидных биорегуляторов и содержащие наиболее часто встречающиеся в соответствующих тканях аминокислоты. Недавние исследования [Чалисова Н.И. и др., 2000, 2003, 2006] показали, что не только короткие пептиды, но и сами аминокислоты обладают некоторыми регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза в различных тканях.
Несмотря на наличие большого количества методов воздействия на стареющую кожу, поиск эффективных физиологических методов и средств профилактики и коррекции возрастных изменений кожи, не оказывающих нежелательного побочного действия, остается актуальной проблемой современной медицины. До последнего времени в медицинской косметологии при коррекции возрастных изменений кожи не принимались во внимание процессы, происходящие на клеточном уровне. Одной из наиболее адекватных моделей для изучения влияния различных препаратов
на структуру и функцию клеток являются органотипические культуры [Калюнов В.П., 1986; Чалисова Н.И. и др., 1998,2006]. Изменение количества клеток в культуре ткани под воздействием различных веществ служит критерием первичной интегральной оценки биологической активности вещества. Поэтому сравнительное изучение действия природных и синтетических пептидов и аминокислот в культуре ткани кожи, как у молодых, так и у старых животных, позволит выяснить некоторые механизмы регулирования клеточных процессов в коже, а также создать базу для синтеза новых пептидных биорегуляторов для гериатрической практики и геронтокосметологии.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было исследование действия природных полипептидов, выделенных из различных тканей, а также синтезированных коротких пептидов и аминокислот на развитие органотипической культуры фрагментов ткани кожи от молодых и старых крыс.
Для достижения цели исследования поставлены и последовательно решены следующие задачи:

Исследовать влияние 20 стандартных аминокислот на клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

Исследовать влияние синтезированных ди-, три- и тетрапептидов на развитие эксплантатов кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

Исследовать действие полипептидов, выделенных из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, на клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

4. Исследовать влияние стандартных аминокислот, полипептидов икоротких пептидов на развитие процессов пролиферации и апоптоза ворганотипической культуре кожи от молодых и старых крыс.
Научная новизна работы
Впервые проведено изучение действия 20 стандартных аминокислот, полипептидов, выделенных из различных тканей, и коротких пептидов в органотипических культурах тканей кожи, взятых от молодых и старых животных. Впервые установлено стимулирующее влияние аминокислот пролина, лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, триптофана и тирозина на процессы пролиферации в культуре ткани кожи от молодых животных и всего 3 аминокислот (тирозина, изолейцина, триптофана) - в эксплантатах кожи от старых животных. Напротив, в культуре ткани кожи от старых животных 7 гіминокислот - глицин, лизин, пролин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, аргинин и валин - вызывали выраженный апоптоз.
Впервые установлено стимулирующее влияние полипептидов, выделенных из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, на клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани. Впервые установлено, что эффективными
в отношении стимуляции пролиферации эксплантатов кожи от молодых животных были дипептиды АВ-17 и АВ-А, а также трипептиды Т-32, Т-33, Т-36, Т-38, а эксплантатов кожи от старых крыс - только трипептид Т-38 и дипептиды АВ-17 и АВ-А. Впервые установлено, что тетрапептиды кортаген, эпиталон, кардиоген, ливаген, простамакс стимулируют развитие эксплантатов кожи молодых крыс, а в эксплантатах кожи старых крыс активным в отношении пролиферации является только простамакс.
Впервые проведено иммуноцитохимическое исследование эксплантатов кожи и выявлено уменьшение развития процессов апоптоза при стимуляции пролиферации под влиянием вышеуказанных препаратов. При этом показано, что увеличение индекса площади эксплантатов кожи находится в положительной корреляции с увеличением площади экспрессии маркера пролиферации PCNA и в отрицательной корреляции с уменьшением площади экспрессии проапоптозного белка р53.
Практическая значимость работы
Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что при старении уменьшается спектр аминокислот, активно действующих на пролиферативные процессы в коже. Напротив, полипептиды, выделенные из различных тканей, и короткие пептиды проявляют стимулирующие пролиферацию свойства в отношении кожи у животных как молодого, так и старого возраста. Выявленное стимулирующее действие природных и синтезированных пептидов на кожу создает основу для их дальнейшего изучения в качестве средств, предназначенных для коррекции возрастных изменений кожи. Установленное стимулирующее действие коротких пептидов в отношении клеточной пролиферации в тканях кожи создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для использования в геронтокосметологии и в гериатрической практике.
Положения, выносимые на защиту
1. Аминокислоты - пролин, лизин, глутаминовая кислота, аргинин,триптофан и тирозин обладают способностью стимулироватьпролиферативные процессы в ткани кожи молодых крыс. В ткани кожи отстарых животных только 3 аминокислоты - тирозин, изолейцин, триптофан -проявляют активность в отношении клеточной пролиферации.
2. Дипептиды АВ-17 и АВ-А стимулируют пролиферацию вэксплантатах кожи молодых и старых крыс. В органотипической культурекожи молодых животных пролиферативные процессы стимулируюттрипептиды Т-32, Т-33, Т-36, Т-38, в органотипической культуре кожистарых животных - только трипептид Т-38.
3. Тетрапептиды кортаген, эпиталон, кардиоген, ливаген, простамакс,панкраген стимулируют развитие эксплантатов кожи молодых крыс, а ворганотипической культуре кожи старых крыс активным в отношениипролиферации является только тетрапептид простамакс.
4. Полипептиды, экстрагированные из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, стимулируют клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи как молодых, так и старых животных.
5. Площадь экспрессии маркера пролиферации PCNA находится вположительной, а площадь экспрессии проапоптозного белка р53 - вотрицательной корреляции с изменением индекса площади эксплантатов ворганотипической культуре кожи молодых и старых крыс в присутствииаминокислот, дипептидов, трипептидов, тетрапептидов и полипептидов,экстрагированных из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц.
6. Полипептиды, экстрагированные из тканей хряща, яичников, тимуса,сосудов, мышц, тетрапептид простамакс, трипептид Т-38, дипептиды АВ-17и АВ-А являются перспективными веществами для создания средств,предназначенных для коррекции возрастных изменений кожи.
Связь с планом НИР
Диссертационная работа выполнена в рамках основного плана НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 7 статей, включая 5 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки Российской Федерации для опубликования материалов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора- литературы, главы с описанием материалов и методов, главы собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 110 страницах, содержит б таблиц, иллюстрирован 28 рисунками. Список литературы содержит 158 источников, из них 94 отечественныхи64 зарубежных авторов.
Апробация и реализация диссертации
Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург - Колгуши, 2010), I всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (Барнаул, 2011), VI международном научном конгрессе валеологов «Здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2011), юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2011), XVI международной научно-практической конференции "Пожилой больной. Качество жизни" (Москва, 2011), Всероссийской молодежной конференции-школы «Нейробиологая интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011), 4 Всероссийской с международным участием научной конференции «Метромед-2011» (Санкт-Петербург, 2011).