ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ ЭПИФИЗА НА ФИБРОБЛАСТЫ КОЖИ ПРИ СТАРЕНИИ ОРЛОВА, ОКСАНА АНАТОЛЬЕВНА

Короткий опис

Орлова Оксана Анатольевна. Влияние пептидов эпифиза на фибробласты кожи при старении: диссертация ... кандидата Биологических наук: 14.01.30 / Орлова Оксана Анатольевна;[Место защиты: АННОВО Научно-исследовательский центр Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии], 2017
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИкандидат наук ОРЛОВА, ОКСАНА АНАТОЛЬЕВНА
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТАРЕНИЕ КОЖИ И СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ГЕРОНТОКОСМЕТОЛОГИИ
1.1. Гистологические особенности строения кожи
1.2. Генетические и эпигенетические факторы старения кожи
1.3. Экспрессия нейроэндокринных сигнальных молекул клетками кожи при старении
1.3.1. Молекула адгезии ICAM-1: регуляция воспалительных процессов в коже при старении
1.3.2. Роль проапоптотических белков в старении эпидермиса и дермы
1.4. Иммунная функция кожи при старении
1.5. Геропротекторные средства в косметологии: гиалуроновая кислота и пептидные биорегуляторы
1.6. Аппаратная эстетическая косметология
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выделение первичной культуры фибробластов кожи крыс
2.2. Приготовление раствора пептидов для добавления в культуру клеток
2.3. Построение кривой клеточного роста
2.4. Иммуноцитохимическое исследование
2.5. Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений
2.6. Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Влияние пептидов эпифиза на рост фибробластов кожи
3.1.1. Влияние пептида АБЭО на рост фибробластов кожи
3.1.2. Влияние полипептидного комплекса эпифиза на рост фибробластов кожи
2
3.2. Влияние пептидов эпифиза на экспрессию проапоптотического белка р53 в фибробластах кожи при старении
3.3. Влияние пептидов эпифиза на экспрессию маркера клеточного старения р16 в фибробластах кожи при старении
3.4. Влияние пептидов эпифиза на экспрессию проапоптотического белка Савраве-3 в фибробластах кожи при старении
3.5. Влияние пептидов эпифиза на экспрессию Sirtum-6 в фибробластах кожи при старении
3.6. Влияние пептидов эпифиза на экспрессию CD98hc в фибробластах кожи при старении
3.7. Влияние пептидов эпифиза на экспрессию белка ремоделирования межклеточного матрикса ММР9 в фибробластах кожи при старении
3.8. Влияние пептидов эпифиза на экспрессию пролиферотропного белка К167 в фибробластах кожи при старении
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ

Список літератури

Молекула адгезии ICAM-1: регуляция воспалительных процессов в коже при старении
Процесс старения кожи обусловлен как эпигенетическими, так и генетическими факторами. Генетические структурные изменения кожи являются следствием метилирования генов, кодирующих сигнальные молекулы, регулирующие функциональную активность клеток кожи, и носят индивидуальный характер [Gnter R., Sabine H., Dvir A. et al. Aging is associated with highly defined epigenetic changes in the human epidermis // Epigenetics & Chromatin. 2013. V. 6. P. 36]. Генетические и эпигенетические факторы старения вызывают гистологические изменения кожи, которые заключаются в уплощении эпидермальных гребней, ослаблении поверхностных контактов между эпидермисом и дермой, что приводит к ухудшению обмена питательными веществами и метаболитами между слоями кожи. Скорость процесса старения неодинакова у мужчин и женщин и зависит от гормонального фона организма [Thornton M.J. Estrogens and aging skin // Dermato-Endocrinology. 2013. V. 5. N 2. P. 264-270; Castelo-Branco C., Davila J. Menopause and Aging Skin in the Elderly. Springer, 2015. P. 345-357]. Эпигенетические факторы, включающие воздействие солнечных лучей, загрязнение окружающей среды, курение, повторяющиеся движения лицевых мышц, образ жизни, могут контролироваться с помощью различных профилактических мер [Kligman L.H. Photoaging. Manifestations, prevention, and treatment // Clin Geriatr Med. 1989. - V. 5. - P. 235251]. К эпигенетическим факторам, прежде всего, относят повреждение кожи ультрафиолетом, который проникает внутрь дермы и инициирует каскад молекулярных и клеточных ответов, тем самым, являясь причиной повреждений кожи и ее старения [Thomas A.R., Howard Y.C. Aging, Rejuvenation, and Epigenetic Reprogramming: Resetting the Aging Clock // Cell. 2012. V. 148. N 1-2. P. 46-57; Amy R.V., Rafael A.I., Kasper D.H. et al. Age and sun exposure-related widespread genomic blocks of hypomethylation in nonmalignant skin // Genome Biology. 2015. V. 16. N 1. P. 80]. Индуцируемый ультрафиолетом синтез матриксных металлопротеиназ (MMP), сериновых протеаз (эластазы нейтрофилов), эластазы фибробластов, свободных радикалов и фактора пигментной ксеродермы приводит к деградации или повреждению дермального коллагена и компонентов внеклеточного матрикса, способствуя инвагинации эпидермиса [Amano S. Possible Involvement of Basement Membrane Damage by Matrix Metalloproteinases, Serine Proteinases, and Heparanase in Skin Aging Process. Springer, 2016. P. 149-160]. Кроме того, УФ-излучение является причиной истощения клеточных и ферментативных антиоксидантов (супероксиддисмутазы и каталазы) и активирует нейроэндокринную систему, приводя к иммуносупрессии и высвобождению нейроэндокринных медиаторов [Pandel R., Poljak B., Godic A., Dahmane R. Skin Photoaging and the Role of Antioxidants in Its Prevention // ISRN Dermatology. 2013. V. 2013: 930164]. На клеточном уровне УФ-изучение индуцирует продукцию цитокинов, поверхностную экспрессию адгезионных молекул и воздействует на такие клеточные процессы, как митоз, апоптоз и некроз [Чайковская Е., Губанова Е. Фотостарение и биологическое старение кожи. - М.: Нувель Эстетик — «Алмаз-пресс», 2003. - № 4. - С. 44-50]. ММP-1 инициирует расщепление фибриллярного коллагена I и III типа в дерме, который в дальнейшем разрушается ММP-2 и ММP-9 [Yao C., Lee D.H., Oh J.H. Poly(I:C) induces expressions of MMP-1, -2, and -3 through various signaling pathways including IRF3 in human skin fibroblasts // Journal of Dermatological Science. 2015. V. 80. N 1. P. 54-69]. Коэкспрессия ММP-2, ММP-3 и ММP-9 приводит к деградации неколлагеновых компонентов дермы, включая гликопротеины и протеогликаны базальной мембраны [Ravanti L., Kahari V.M. Matrix metalloproteinases in wound repair (review) // Int J Mol Med. - 2000. - V. 6. - P. 391407]. В коже при старении ММP присутствуют в более активном состоянии, поскольку уровень тканевых ингибиторов ММP снижается [Yao C., Lee D.H., Oh J.H. Poly(I:C) induces expressions of MMP-1, -2, and -3 through various signaling pathways including IRF3 in human skin fibroblasts // Journal of Dermatological Science. 2015. V. 80. N 1. P. 54-18 69]. Взаимодействие кожи с УФ в первые часы приводит к легкому снижению уровня гиалуроновой кислоты (ГК), а затем к его увеличению и активному обновлению в дерме. Вследствие этого, кожа, стареющая в результате УФ облучения, содержит меньше ГК, чем молодая кожа, так как происходит истощение ее клеток [Papakonstantinou E., Roth M., Karakiulakis G. Hyaluronic acid: A key molecule in skin aging // Dermato-Endocrinology. 2012. - V. 4. N 3. P. 253-258]. Дополнительный негативный эффект от УФ облучения включает прямые воздействия на кератиноциты, такие как индукция некоторых интерлейкинов (IL) и фактора некроза опухоли- (TNF ), приводящие к инфильтрации кожи фагоцитами, которые секретируют эти цитокины [Снарская Е.С., Рябцева А.А., Сурикова Н.Н. Кумулятивные эффекты воздействия ультрафиолетового излучения на развитие патологии кожи и глаз // Вестник оптометрии. - 2009. - № 6. - C. 53—58]. IL-1 и TNF- увеличивают скорость деградации протеоглиганов и ингибируют их биосинтез. TGF- и инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1) оказывают противоположный эффект, индуцируя синтез протеогликанов [Kim M.S., Song H.J., Lee S.H., Lee C.K. Comparative study of various growth factors and cytokines on type I collagen and hyaluronan production in human dermal fibroblasts // Journal of cosmetic dermatology. 2014. V. 13. N 1. - P. 4451]. Уровень простагландинов и других медиаторов воспаления, таких как гистамин и лейкотриены, а также гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора также возрастает в ответ на взаимодействие с УФ. Эти провоспалительные медиаторы увеличивают проницаемость капилляров, приводя к инфильтрации и активации нейтрофилов и других фагоцитирующих клеток в коже [Muller H.K., Woods G.M. Ultraviolet Radiation Effects on the Proteome of Skin Cells // Advances in Experimental Medicine and Biology. 2013. - V. 990. P. 111-119]. Активные формы кислорода продуцируются, главным образом, фагоцитами и многоядерными лимфоцитами и являются причиной оксидативных повреждений клеточных белков, жиров, углеводов и ДНК [Clinical Dermatology: a Color Guide to Diagnosis and Therapy. Thomas P. Habif, M.D. Light-Related Disease and Disorders of Pigmentations. - 3rd ed.Mosby. Hanover, New Hapshire, 1996. - 608 p; Вульф К., Джонсон Р., Сюрмонд Д. Фотодерматозы и лучевой дерматит — дерматология по Томасу Фицпатрику. Атлас-справочник. - 2-ое изд. М.: «Практика», 2007. - 234 c.]. Одним из первичных событий кислород-опосредованного воспаления является активация транскрипционных факторов. Ядерный фактор NF-B и активаторный белок-1 (AP-1) являются транскрипционными факторами, участвующими в регуляции экспрессии генов, вовлеченных в иммунные и воспалительные ответы (гены, кодирующие цитокины, MMP, адгезионные молекулы, регуляторы клеточного роста, дифференцировки и апоптоза). Индуцируемое свободными радикалами перекисное окисление липидов способствует увеличению активности фосфолипазы. Это в свою очередь, приводит к усиленной продукции простагландинов. Фагоциты в дальнейшем стимулируют синтез и секрецию кератиноцитами элафина ингибитора эластазы нейтрофилов человека, который впоследствии ограничивает повреждения, вызванные нейтрофилами [Rgnier M., Schmidt R, Bernerd F. Gene expression profiles of three different models of reconstructed human epidermis and classical cultures of keratinocytes using cDNA arrays // Arch Dermatol Res. - 2004. - V. 296. - P. 145-56; Обухова Л.К., Эммануэль Н.М. Роль свободнорадикальных реакций окисления в молекулярных механизмах старения живых организмов // Успехи химии. - 1983. - Т. 52. - С. 353-372; Огрызко Е.В., Иванов М.А. Эпидемиологическая ситуация по заболеваемости кожи в Российской Федерации в 2000—2006 гг. // Росс. журн. кожн. и вен. Болезней. 2008. - № 6. C. 4-8; Франк Г.А., Снарская Е.С., Завалишина Л.Э. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы при базально-клеточном и метатипическом раке кожи // Архив патологии. -2005. - № 1. - С. 12—15].
Приготовление раствора пептидов для добавления в культуру клеток
Для исследования использовали ППЭ и пептид AEDG в форме лиофилизированного порошка. Разведение пептидов выполняли по следующей схеме: 1. Точную навеску (5 мг) пептида AEDG или ППЭ растворяли в 100 мл среды M199 в стерильной колбе и перемешивали в течение 10 мин (конечная концентрация раствора пептидов составила 50 мкг/мл). 2. Затем 1 мл полученного раствора переносили в стерильную посуду и добавили 49 мл среды M199. Таким образом, концентрация пептидов в полученном растворе составляла 1000 нг/мл. 3. Для достижения концентрации пептидов 100 нг/мл на 0,9 мл конечного объема ростовой среды добавляли 0,1 мкл раствора пептида с концентрацией 1000 нг/мл. Пептид AEDG был синтезирован на основе аминокислотного анализа
ППЭ. По данным ранее проведенных экспериментов в культурах клеток и на животных пептид AEDG обладает антиоксидантной активностью, регулирует синтез мелатонина, обладает иммуностимулирующими свойствами, снижает риск развития опухолевых заболеваний, регулирует функциональную активность нейроиммуноэндокринной системы, способствует увеличению длины теломер в нормальных фибробластах и преодолению лимита Хейфлика [Anisimov V.N., Khavinson V.Kh. // Biogerontology. 2010. N. 11. P. 139-149]. Пептид AEDG способствует регенерации сетчатки при различных дистрофических поражениях и индуцирует восстановление ее световой чувствительности при зрительной дезадаптации [Линькова Н.С., Проняева В.Е., Дудков А.В., Трофимова С.В. Молекулярные механизмы ретинопротекторного действия коротких пептидов // Российский семейный врач. 2013. Т. 17. - № 3. - С. 22-24]. Введение самцам и самкам крыс пептида AEDG оказывало нормализующее влияние на свободно-радикальные процессы, большинство гормонально-метаболических и поведенческих показателей у животных, содержавшихся в условиях постоянного или естественного режимов освещения. Применение пептидов AEDG у животных приводило к замедлению процессов старения, снижению темпов развития возрастной патологии и увеличению продолжительности жизни. На органотипических культурах клеток кожи крыс разного возраста было показано, что пептид AEDG стимулирует рост эксплантатов [Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. 35-летний опыт исследований пептидной регуляции старения // Успехи геронтологии. 2009. Т. 22. - № 1. С. 11-23]. Исследование эффективности кремов с содержанием пептида AEDG показало, что его применение способствует повышению влагосодержания в поверхностных слоях кожи, визуально уменьшает рельеф морщин шеи и лица у женщин пожилого возраста [Чалисова Н.И., Линькова Н.С., Жекалов А.Н., Орлова А.О., Рыжак Г.А., Хавинсон В.Х. Короткие пептиды стимулируют клеточную регенерацию в коже при старении // Успехи геронтологии. - 2014. - Т. 27. - № 4. - С. 699 - 703]. ППЭ выделен из эпифиза головного мозга телят, и является эффективным средством в лечении гормонозависимых опухолей, дисгормональной миокардиодистрофии, последствий стрессорных воздействий на организм, восстанавливает гистологическую структуру селезенки после эпифизэктомии и способствуют нормализации ее иммунной функции [Линькова Н.С., Хавинсон В.Х., Трофимов А.В., Дудков А.В. Компенсаторное действие пептидов эпифиза на органы иммунной и эндокринной систем у эпифизэктомированных крыс // Научные ведомости. 2011. Т. 13. - № 4. C. 81-85; Прилепская В.Н., Богатова И.К., Радзинский В.Е. Новое в профилактике и терапии климактерического синдрома // Гинекология. 2016. Т. 18. - № 1. C. 7-12]. Этот пептидный препарат в экспериментах способствовал достоверному увеличению средней и максимальной продолжительности жизни мышей и крыс, замедлению у них старения репродуктивной системы, повышению двигательной активности и физической выносливости [Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. 35-летний опыт исследований пептидной регуляции старения // Успехи геронтологии. 2009. Т. 22. - № 1. С. 11-23].
Установлено, что ППЭ и синтетический пептид AEDG способствуют замедлению процесса старения клеток кожи. В основе их действия лежат молекулярные механизмы, связанные с эпигенетической регуляцией экспрессии генов и синтеза белков [Khavinson V.Kh., Soloviev A.Yu ., Tarnovskaya S.I. et al. Mechanism of biological activity of short peptides: Cell penetration and epigenetic regulation of gene expression // Biology Bulletin Reviews. - 2013. - V. 3. - N. 6. - P. 451-455].
Для построения кривой клеточного роста фибробласты кожи 3 пассажа рассеивали в три 24-луночных планшета (один планшет для одной линии клеток). В восьми лунках планшета выращивали контрольные образцы культуры, в 8 лунках к культуре добавляли пептид AEDG и в 8 лунках - ППЭ. В первом планшете концентрация пептидов составила 10 нг/мл, во втором планшете - 100 нг/мл, в третьем планшете - 1000 нг/мл.
В каждую ячейку планшета добавляли клетки в концентрации 20 000 на 2 мл, среду и пептиды добавляли таким образом, чтобы общий объем раствора в ячейке составлял 2 мл. В контрольных образцах культуры клеток вместо пептида добавляли аналогичное количество питательной среды. На 2-5 сутки культивирования клетки снимали с поверхности ячеек планшетов трипсин-версеном. Подсчет клеток осуществляли из расчета на 1 мл в камере
Горяева в 16 квадратах (по полученным данным рассчитывали среднее значение клеток в 1 квадрате). Для подсчета клеток в камере Горяева и получения микрофотографий использовали инвертированный микроскоп Nikon и компьютер.