ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ФАРМАКОДИНАМІКИ ТА МЕХАНІЗМУ ДІЇ НОВОЇ ГРУПИ ПРИРОДНИХ АНТИОКСИДАНТІВ НА ОСНОВІ ЕЛАГОТАНІНІВ

brief description

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

На правах рукопису

Сахарова Тетяна Семенівна

УДК 615.322:577.38:547.983

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ФАРМАКОДИНАМІКИ ТА МЕХАНІЗМУ ДІЇ НОВОЇ ГРУПИ ПРИРОДНИХ АНТИОКСИДАНТІВ НА ОСНОВІ ЕЛАГОТАНІНІВ

14.03.05 фармакологія (фармацевтичні науки)

Дисертація на здобуття наукового ступеня
доктора фармацевтичних наук

Науковий консультант
Яковлєва Лариса Василівна
доктор фармацевтичних наук,
професор

Харків 2008

ЗМІСТ

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ.......................................................................6
ВСТУП .......................................................................................................................8
РОЗДІЛ 1
РОЛЬ РОСЛИННИХ ПОЛІФЕНОЛЬНИХ СПОЛУК У РЕГУЛЯЦІЇ ПРОЦЕСУ ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСНЕННЯ ЯК ОДНІЄЇ ІЗ ПРОВІДНИХ ЛАНОК ПАТОГЕНЕЗУ ЗАХВОРЮВАНЬ ВНУТРІШНІХ ОРГАНІВ (огляд літератури)......16
1.1. Сучасні уявлення про характер зрушень окисного метаболізму при захворюваннях шлунково-кишкового тракту, печінки та серцево-судинної системи.............18
1.2. Внесок рослинних поліфенольних сполук у забезпечення неспецифічної резистентності організму щодо надмірної активації процесу вільнорадикального окиснення та досвід їхнього застосування у практичній медицині........37
1.3. Елаготаніни перспективна група рослинних поліфенольних сполук для створення ефективних та безпечних лікарських препаратів антиоксидантної дії 54
РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ......................................................67
РОЗДІЛ 3
ВИВЧЕННЯ МЕХАНІЗМІВ ФАРМАКОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ ОРИГІНАЛЬНИХ ЕЛАГОТАНІНОВМІЩУЮЧИХ ПРЕПАРАТІВ АЛЬТАНУ ТА ЕЛГАЦИНУ У ПОРІВНЯННІ З КВЕРЦЕТИНОМ І СИЛІБОРОМ ........87
3.1.Оцінка сумарної протиокисної активності альтану та елгацину у порівнянні з кверцетином і силібором....87
3.2. Дослідження прямих антирадикальних властивостей елаготаніновміщуючих препаратів порівняно з кверцетином і силібором...................................89
3.2.1. Визначення здатності альтану та елгацину до інактивації супероксидних радикалів...............................................................................90
3.2.2. Визначення здатності альтану та елгацину до знешкодження гідроксильних радикалів........................................................................................94
3.3. Вивчення впливу альтану та елгацину на Fe2+-індуковані ланки мікросомального ліпопереокиснення...............................96
РОЗДІЛ 4
ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ АЛЬТАНУ ТА ЕЛГАЦИНУ НА СТАН ФІЗІОЛОГІЧНИХ СИСТЕМ НЕСПЕЦИФІЧНОЇ РЕЗИСТЕНТНОСТІ ЩОДО ЗРУШЕНЬ ОКИСНОГО МЕТАБОЛІЗМУ ......................101
4.1. Дослідження модулюючого впливу елаготаніновміщуючих препаратів на функціональний стан ферментативних систем, задіяних у процесі вільнорадикального окиснення ........................101
4.1.1. Вплив альтану та елгацину на активність ферменту ксантиноксидази ...101
4.1.2. Вплив альтану та елгацину на перебіг запальних патологій, опосередкованих активацією ліпооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти ............................................................................................................103
4.1.3. Вплив альтану та елгацину на функціонування глутатіонзалежного поліферментного комплексу..............................................107
4.2. Дослідження мембранотропних ефектів елаготаніновміщуючих препаратів у порівнянні з кверцетином і силібором ..113
4.2.1. Визначення впливу альтану та елгацину на структурно-динамічні властивості плазматичної мембрани за допомогою методу електронного парамагнітного резонансу......................................................................................113
4.2.2. Дослідження мембранопротекторних властивостей елаготаніновміщуючих препаратів на моделях пероксидного ушкодження плазматичної та мікросомальної мембран....................................................................................118
РОЗДІЛ 5
ВИВЧЕННЯ ФАРМАКОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ ОРИГІНАЛЬНИХ ЕЛАГОТАНІНОВМІЩУЮЧИХ ПРЕПАРАТІВ АЛЬТАНУ ТА ЕЛГАЦИНУ В УМОВАХ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ПАТОЛОГІЙ ОРГАНІВ ШЛУНКОВО-КИШКОВОГО ТРАКТУ ТА ПЕЧІНКИ У ПОРІВНЯННІ З КВЕРЦЕТИНОМ І СИЛІБОРОМ................................................................122
5.1. Дослідження терапевтичної ефективності елаготаніновміщуючих препаратів при експериментальних виразкових ураженнях органів шлунково-кишкового тракту у порівнянні з кверцетином і силібором...........................122
5.1.1. Гастропротекторна активність альтану та елгацину при експериментальній оцтовокислій виразці шлунка у білих щурів...................................122
5.1.2. Противиразкова дія альтану та елгацину при експериментальному оцтовокислому коліті у білих щурів..................................................................134
5.2. Визначення терапевтичної ефективності елаготаніновміщуючих препаратів при експериментальних токсичних ураженнях печінки у порівнянні з кверцетином і силібором................................................................................149
5.2.1. Гепатопротекторна дія альтану та елгацину при гострому тетрахлорметановому гепатиті у білих щурів.......................................................................149
5.2.2. Гепатопротекторна активність альтану та елгацину при тетрацикліновому гепатиті у білих щурів...........................................................................162
РОЗДІЛ 6
ВИВЧЕННЯ ФАРМАКОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ АЛЬТАНУ ТА ЕЛГАЦИНУ В УМОВАХ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ПАТОЛОГІЙ ОРГАНІВ СЕРЦЕВО-СУДИННОЇ СИСТЕМИ У ПОРІВНЯННІ З КВЕРЦЕТИНОМ І СИЛІБОРОМ ...........................................................................170
6.1. Вивчення гіполіпідемічної активності елаготаніновміщуючих препаратів у порівнянні з кверцетином і силібором..................................................................170
6.1.1. Гіполіпідемічна дія альтану та елгацину при експериментальній гіперліпідемії у білих щурів.................................................................................170
6.1.2. Гіполіпідемічна дія альтану та елгацину при експериментальному атеросклерозі у кролів.........................................................................................176
6.2. Дослідження кардіопротекторної активності елаготаніновміщуючих препаратів у порівнянні з кверцетином і силібором..................................................194
6.2.1. Кардіопротекторна дія альтану та елгацину при гострому ізадриновому міокардиті у білих щурів ......................................................................194
6.2.2. Кардіопротекторна дія елаготаніновміщуючих препаратів при доксорубіциновій міокардіодистрофії у білих щурів............................................208

РОЗДІЛ 7
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ДОЦІЛЬНОСТІ СТВОРЕННЯ НА ОСНОВІ ЕЛГАЦИНУ ОРИГІНАЛЬНОГО КАРДІОПРОТЕКТОРНОГО ЛІКАРСЬКОГО ЗАСОБУ АНТИОКСИДАНТНОЇ ДІЇ...........221
7.1. Дослідження кардіопротекторної активності таблеток елгацину у порівнянні із субстанцією елгацину та кверцетином ............................221
7.1.1. Кардіопротекторна активність таблеток елгацину на моделі гострого ізадринового міокардиту у білих щурів ...221
7.1.2. Кардіопротекторна активність таблеток елгацину на моделі доксорубіцинової міокардіодистрофії у білих щурів ...............230
7.1.3. Кардіопротекторна активність таблеток елгацину на моделі етанол-фуразолідонової кардіоміопатії у білих щурів 239

АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ....................255

ВИСНОВКИ.........................................................................................................323

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ...........................................................326

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
АГП ацилгідроперекиси
АК арахідонова кислота
АО антиоксиданти
АОЗ антиоксидантний захист
АОС антиоксидантна система
АФК активні форми кисню
АЦ аденілатциклаза
ВГ відновлений глутатіон
ВР вільний радикал
ВРО вільнорадикальне окиснення
ГПО глутатіонпероксидаза
ГР глутатіонредуктаза
ГТ глутатіонтрансфераза
Г6ФД глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа
ДК дієнові кон’югати
ДПК дванадцятипала кишка
ДР дубильні речовини
ЖК жирні кислоти
ЖЛ жовточні ліпопротеїни
ЗБ загальний білок
ЗХ загальний холестери
ЕК елагова кислота
ЕПР електропарамагнітний резонанас
ЕФР ендотеліальний фактор релаксації
ЕХС естерифікований холестерин
і-NOS індуцибельна NO-синтетаза
с-NOS конститутивна NO-синтетаза
КД ксантиндегідрогеназа
КО ксантиноксидаза
КФК креатинфосфокіназа
КХА катехоламіни
ЛДГ лактатдегідрогеназа
ЛО ліпооксигеназа
ЛПВЩ ліпопротеїни високої щільності
ЛПДНЩ ліпопротеїни дуже низької щільності
ЛПНЩ ліпопротеїни низької щільності
ЛТ лейкотрієни
NO монооксид азоту
ОЗФ оксидази зі змішаними функціями
ПВШ пептична виразка шлунка
ПГ простагландини
ПОЛ перекисне окиснення ліпідів
ПОС прооксидантна система
ПХ пілоричний хелікобактер
ПЯЛ поліморфноядерні лейкоцити
СОА супероксидний аніон
СОД супероксиддисмутаза
CОК слизова оболонка кишечника
СОШ слизова оболонка шлунка
СПОА сумарна антиокисна активність
ССС серцево-судинна система
ТАГ триацилгліцерини
ТБК тіобарбітурова кислота
ТБК-АП ТБК-активні продукти
ФЛ фосфоліпіди
ЦОГ циклооксигеназа
ШКТ шлунково-кишковий тракт

ВСТУП

За останні десятиріччя свого існування теорія вільнорадикального генезу різноманітних патологічних станів у організмі людини не лише не втратила значення, але й постійно збагачується новими вагомими даними, що підкреслюють її коректність та актуальність. Ознакою часу стала популяризація понять активні форми кисню”, вільні радикали” та антиоксиданти”, які вийшли за межі наукових лабораторій і стали доступними для розуміння на рівні пересічного громадянина.
Окисні реакції за участю вільних радикалів (ВР) виступають провідним патогенетичним фактором захворювань, які позначаються терміном вільнорадикальні патології” і становлять на сьогодні близько 60% усіх відомих нозологій. До них належать кардіопатології ішемічного та гіпоксичного генезу, атеросклероз, захворювання печінки, виразкові ураження органів шлунково-кишкового тракту, пухлинний процес тощо [19, 52, 53, 156, 162, 208, 306, 363, 365]. Загальним для цих захворювань є посилення вільнорадикальних процесів, зниження буферної ємності антиоксидантної системи (АОС) і порушення мобілізації її у відповідь на підвищення активності прооксидантної системи (ПОС). Незалежно від причин, які призводять до інтенсифікації вільнорадикальних процесів, зміни на молекулярному рівні мають однотипний характер і процеси генерації активних форм кисню (АФК) тісно пов‘язані між собою. Найбільш вивченими джерелами надмірної продукції АФК вважаються дихальний/метаболічний вибух” поліморфноядерних лейкоцитів; ксантиноксидазна реакція; мітохондріальне дихання; процес біотрансформації ксенобіотиків за участю мікросомальних монооксигеназ; процес деградації арахідонової кислоти; аутоокиснення катехоламінів, тіолів та ін.; утворення ендотеліального фактору релаксації тощо [54, 65, 100, 306, 363]. Разом із тим при визначенні ініціативних ланок патогенезу тієї чи іншої вільнорадикальної патології важливим уявляється врахування органної та тканинної специфічності, зумовлених особливостями метаболізму. Так, при запальних процесах у відділах шлунково-кишкового тракту пусковим фактором інтенсифікації вільнорадикальних процесів є дихальний вибух”, при хімічних ураженнях печінки активація системи мікросомального окиснення, при гіпоксії серцевого м‘язу порушення системи тканинного дихання, провідним фактором атерогенезу вважається активація нейтрофілів внаслідок накопичення і наступної модифікації атерогенних ліпопротеїнів [12, 35, 143, 154, 343]. Сучасною загальноприйнятою точкою зору відносно імовірності розвитку та прогресування тієї чи іншої вільнорадикальної патології є оцінка збалансованості систем генерації ВР і функціонального стану фізіологічної антиоксидантної системи. Провідна роль у зазначеному співвідношенні належить АОС. В умовах недостатньої потужності антиоксидантних систем або їхнього ушкодження відбувається реалізація альтеруючих ефектів вільних радикалів, що є передумовою розвитку багатьох патологічних станів [27, 33, 54, 176, 208, 305]. Саме тому зменшення співвідношення прооксиданти/антиоксиданти є найбільш суттєвим фактором, який протистоїть ініціації процесу ВРО і виникненню кисневої токсичності (окисного стресу”) [27, 59, 60, 143, 197, 297, 306]. З цих позицій можна обговорювати універсальність дії природних антиоксидантів, а отже, і можливість їхнього застосування як засобів патогенетичної терапії при будь-якій вільнорадикальній патології [32, 90, 112, 125, 154, 173, 286]. Не викликає сумнівів і медична значущість антиоксидантів у профілактиці цілої низки захворювань. Проблема набуває соціальної ваги у нашій країні в умовах несприятливого довкілля (екологічного стану) та незбалансованості харчування. Перспективність використання природних антиоксидантів зумовлюється тим, що ці біологічно активні сполуки виступають природними агентами обміну речовин, не порушують хімічний гомеостаз організму, характеризуються низькою токсичністю.
Найпоширеніша у природі група екзогенних біоантиоксидантів представлена фенольними сполуками, потенційні протиокиснювальні властивості яких детерміновані хімічною структурою [8, 143, 144, 246, 288, 357, 426]. Серед природних поліфенольних сполук нашу увагу привернули рослинні дубильні речовини з групи елаготанінів. Різноманітний спектр біологічної активності та безпечність елаготанінів, достатність та доступність вітчизняних рослинних джерел для промислового отримання [75, 101, 262, 287, 288, 476] виступають безперечним обгрунтуванням необхідності пошуку, розробки та створення на їх основі нової групи лікарських засобів антиоксидантної дії природного походження.
Представлена робота присвячена фармакологічному вивченню оригінальних вітчизняних елаготаніновміщуючих препаратів альтану і елгацину у порівнянні з відомими рослинними флавоноїдвміщуючими препаратами кверцетином і силібором, які на сьогодні широко використовуються в медичній практиці.
Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету з проблеми МОЗ України Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини, у тому числі продуктів бджільництва, для дорослих та дітей” (№ Державної реєстрації 0198U007008).
Мета і завдання дослідження. Метою дослідження стало експериментальне обгрунтування доцільності впровадження у медичну практику нової групи антиоксидантних засобів природного походження на основі елаготанінів.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:
І. З’ясувати складові механізму фармакологічної дії альтану та елгацину у порівнянні з відомими флавоноїдними препаратами кверцетином і силібором. Для цього:
1) дослідити вплив альтану і елгацину на ініціативні ланки ВРО, які зумовлюються генерацією радикальних форм кисню, зокрема супероксиданіоном та гідроксильним радикалом, а також каталітичною активністю іонів двовалентного заліза, у адекватних модельних системах;
2) визначити регулюючий вплив альтану і елгацину на функціональний стан ферментних систем, задіяних у окисних процесах радикального характеру , а саме, на активність ферменту ксантиноксидази, перебіг ліпооксигеназного шляху катаболізму арахідонової кислоти, на активність глутатіонзалежного поліферментного комплексу;
3) дослідити мембранотропні ефекти альтану і елгацину: мембраномодулювальні властивості за допомогою методу ЕПР та мембраностабілізувальну активність на моделях пероксидного ушкодження плазматичної і мікросомальної мембран.
ІІ. Визначити терапевтичну ефективність альтану і елгацину на експериментальних моделях патологій органів шлунково-кишкового тракту, печінки, серцево-судинної системи у порівнянні з кверцетином і силібором:
1) дослідити лікувальний ефект альтану і елгацину при експериментальних виразкових ураженнях шлунка і товстого кишечника у білих щурів;
2) визначити гепатопротекторну дію альтану і елгацину на моделях токсичних гепатитів з гострим і субхронічним характером перебігу у білих щурів;
3) дослідити гіполіпідемічний ефект альтану і елгацину при експериментальній гіперліпідемії у білих щурів та експериментальному атеросклерозі у кролів;
4) визначити кардіопротекторну дію альтану і елгацину на моделях токсичного міокардиту та міокардіодистрофії у білих щурів;
5) провести вивчення кардіопротекторної активності лікарської форми елгацину (таблетки елгацину 0,007 г) на моделях гострих та хронічних експериментальних кардіопатологій у порівнянні із субстанцією елгацину та кверцетином;
6) на підставі узагальнення експериментально-теоретичних даних визначити обумовленість фармакодинаміки альтану і елгацину особливостями механізму їхньої дії.
Об'єкт дослідження фармакологічна активність і механізм дії препаратів на основі рослинних поліфенольних сполук у адекватних модельних системах, що відтворюють зрушення окисного метаболізму вільнорадикального ґенезу in vitro та in vivo.
Предмет дослідження субстанція альтану (сер. вип. 291100), субстанція (сер. вип. 011105) і таблетки (сер. вип. 240206) елгацину, виготовлені на ЗАТ НВЦ Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод”, де випуск альтану налагоджено, а випуск елгацину впроваджується у промислове виробництво. Субстанції кверцетину (сер. вип. 070505/13) і силібору (сер. вип. 010100) надані, відповідно, заводами-виробниками ЗАТ НВЦ БХФЗ” і ТОВ ФК Здоров‘я”.
Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані фармакологічні, біохімічні, клініко-лабораторні, фізико-хімічні, фізичні, електрофізіологічні, токсикологічні, гематологічні, гістологічні методи дослідження та методи математичної статистики. Усього використано 55 методів та 12 експериментальних моделей дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. Робота є першим різнобічним фармакологічним дослідженням альтану і елгацину - представників нової групи лікарських засобів метаболічної дії, створених на основі рослинних елаготанінів. Вперше в експериментальних умовах досліджений широкий спектр фармакодинаміки альтану і елгацину. Доведена виражена терапевтична ефективність елаготаніновміщуючих препаратів при виразкових ураженнях органів ШКТ, гострих та хронічних токсичних гепатитах, гіперліпідемії/атеросклерозі, кардіопатологіях дисметаболічного характеру. Встановлені органотропні особливості фармакологічної дії альтану і елгацину. Визначені переваги запропонованих елаготаніновміщуючих антиоксидантів перед відомими флавоноїдними препаратами кверцетином і силібором, які знайшли застосування у медичній практиці. Експериментально обґрунтована доцільність впровадження у практичну кардіологію елгацину як засобу кардіопротекторної терапії та проведений повний комплекс доклінічного дослідження запропонованого препарату. Вперше висвітлені найважливіші молекулярно-біологічні механізми реалізації фармакологічної активності оригінальних вітчизняних елаготаніновміщуючих препаратів. Встановлено, що складовими механізму дії альтану та елгацину є наявність прямого і опосередкованого антирадикального ефекту щодо реактивних форм кисню, здатності до пригнічення каталітичної активності іонів заліза каталізаторів ВРО, захисту ферментативних та неферментативних компонентів АОС, наявність мембраномодулювальних /мембраностабілізувальних властивостей. Вперше проведене співставлення характеру інгібіторного впливу на процес ВРО препаратів на основі елаготанінів і флавоноїдних препаратів кверцетину і силібору та визначені особливості механізму їхньої дії. Одержані експериментальні дані виступають вагомим обґрунтуванням доцільності створення нової групи оригінальних лікарських засобів на основі рослинних елаготанінів.
Наукова новизна роботи підтверджується патентом України на винахід № 64074 «Кардіопротекторний антиоксидантний засіб «Елгацин» від 15.06.2005р.
Практичне значення роботи. У повному обсязі проведені доклінічні дослідження субстанції елгацину та таблеток Елгацин 0,007 г”, пакет НТД за результатами якого представлений до ДФЦ МОЗ України. Промислове виробництво таблеток елгацину здійснює ЗАТ НВЦ „БХФЗ” (м. Київ, Україна).
Впровадження елгацину у практику охорони здоров‘я обумовить поповнення арсеналу вітчизняних антиоксидантів природного походження, які характеризуються високою лікувальною ефективністю та нешкідливістю.
Застосування елгацину у практичній кардіології як препарату вибору сприятиме оптимізації фармакотерапії ішемічної хвороби серця у хворих на стабільну стенокардію ІІ і ІІІ функціональних класів, а також хворих на атеросклероз.
Теоретичні узагальнення щодо фармакологічної активності препаратів дубильних речовин, залежності "структура-фармакологічна дія" у ряду рослинних поліфенольних сполук впроваджені у навчальний процес кафедр фармакології, клінічної фармакології з фармацевтичною опікою, фармакотерапії, ботаніки, фармакогнозії, хімії природних сполук НФаУ, кафедри фармакології, клінічної фармакології та технології лікарських засобів Дніпропетровської державної медичної академії, кафедри фармакології з клінічними фармакологією та фармакотерапією Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, кафедри фармакології з медичною рецептурою Харківського державного медичного університету МОЗ України, використовуються у науковій роботі лабораторії біохімічної фармакології ДП ДНЦЛЗ”, ЦНДЛ НФаУ.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею. Особисто здобувачем проведені патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка, аналіз та систематизація отриманих результатів, сформульовані висновки. Разом з науковим консультантом розроблено програму, визначені мета і завдання дослідження, методичні підходи до експериментального вивчення механізмів дії і фармакодинаміки елаготаніновміщуючих препаратів. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом наведені результати власних експериментальних досліджень. Вивчення впливу альтану і елгацину на структурно-динамічний стан плазматичної мембрани з використанням методу ЕПР проведене на базі Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАНУ (м. Харків), електронно-мікроскопічні дослідження проведені на базі НДІЗІНХ (м. Харків).
Апробація результатів дисертації. Результати наукових досліджень, що увійшли до дисертації, оприлюднені на науково-практичній конференції Вчені України вітчизняній фармації” (м.Харків, 2000 р.), VII, VIIІ, IX Російському національному конгресі "Человек и лекарство" (м. Москва, 2000, 2001, 2002 рр.), ІІІ, ІV Всеукраїнській науково-практичній конференції Новое в клинической фармакологии и фармакотерапии заболеваний внутренних органов” (м.Харків, 2000, 2002 рр.), Республіканській науковій конференції Научные направления в создании лекарственных средств в фармацевтическом секторе Украины” (м.Харків, 2000), XV, XVІ, XVІІ науково-практичній конференції Ліки людині” (м.Харків, 2000, 2001 рр.), ІІ Національному з‘їзді фармакологів України Фармакологія 2001 крок у майбутнє” (м. Дніпропетровськ, 2001 р.), ІІ науково-практичній конференції з міжнародною участю Прискорене старіння та шляхи його профілактики” (м.Одеса, 2001 р.), Республіканській науково-практичній конференції Досягнення і перспективи розвитку у клініці внутрішніх хвороб” (м.Харків, 2001 р.), VІІІ Українському біохімічному з‘їзді (м. Чернівці, 2002 р.), Міжрегіональній науково-практичній конференції Здобутки клінічної і експериментальної медицини” (м. Тернопіль, 2002 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції Фармація ХХІ століття” (м.Харків, 2002 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції Нові вітчизняні розробки лікарських засобів для гастроентерології” (м. Харків, 2004 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції Терапевтичні читання пам‘яті академіка Л.Т. Малої” (м. Харків, 2004 р.), VI Національному з’їзді фармацевтів України (м. Харків, 2005 р.), IV, VІ, VІІ Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології (м. Вінниця, 2004, 2006, 2007 рр.), V VІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції Клінічна фармація в Україні” (м. Харків, 2005, 2007 рр.), Conference on Polyphenols applications is Nutrition and Health (St Julian, Malta, 2006), І Міжнародній науково-практичній конференції Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів” (Тернопіль, 2006 р.), Всеукраїнському симпозіумі з міжнародною участю Растительные полифенолы и неспецифическая резистентность» (м. Одеса, 2006 р.), наукових семінарах ЦНДЛ НФаУ.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковані: 1 монографія, 27 наукових статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 15 тезів доповідей на науково-практичних конференціях та конгресах, отримано 1 патент України на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, п‘яти розділів експериментальних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків і списку використаних джерел. Загальний обсяг дисертації складає 325 сторінок друкованого тексту (без списку використаних джерел). Робота ілюстрована 35 таблицями, 109 рисунками. Перелік використаних джерел містить 477 найменувань (197 кирилицею, 280 латиницею).

bibliography

АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ ОДЕРЖАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ

Розвиток сучасних уявлень про загальнобіологічний характер зрушень окисного метаболізму грунтується на встановленні чільної ролі аномального процесу вільнорадикального окиснення (ВРО), у ініціації якого провідне місце посідає надмірне утворення реактивних метаболітів кисню. Провокація надлишкового утворення АФК на тлі передуючого або динамічного виснаження систем фізіологічного антиоксидантного захисту (АОЗ) спричиняє інтенсифікацію реакцій, що супроводжуються деградацією функціональних біомакромолекул: структурних та транспортних ліпопротеїнів, білків, полісахаридів, нуклеїнових кислот тощо та загибеллю клітини. Можливості корекції підвищеного рівня ВРО як неспецифічної відповіді організму на хворобу створюють обнадійливі перспективи для розвитку одного із новітніх напрямків фармакотерапії - антиоксидантотерапії. Сучасні аспекти пошуку нових ефективних антиоксидантів грунтуються на узагальненні основних механізмів дії інгібіторів ВРО, таких як, антирадикальна активність, інактивація каталізаторів ПОЛ, стабілізація пулу ендогенних антиоксидантів, пригнічення активності прооксидантних систем, захист мембранного структурного антиоксиданту”[27, 60, 88, 305]. Серед нових об‘єктів дослідження перевага надається речовинам природного походження з числа компонентів фізіологічного антиоксидантного захисту, що визначає їхню біологічну сумісність з організмом людини, а, отже, безпечність при тривалому застосуванні [33, 176, 246, 288, 303, 357, 394, 471]. Зважаючи на істотну роль рослинних поліфенольних сполук у забезпеченні АОЗ та досвід застосування препаратів поліфенольного/флавоноїдного складу як антиоксидантів у представленій роботі наведене теоретичне та експериментальне обгрунтування доцільності створення нової групи природних антиоксидантів на основі елаготанінів рослинних поліфенолів з класу гідролізуємих дубильних речовин. З огляду даних сучасної літератури (розділ 1), випливає, що елаготаніни виявляють широкий спектр біологічної активності, а механізм їхньої дії є багатоцільовим і забезпечується не лише втручанням у ключові етапи процесу ВРО, але й торкається інших ланок зрушення клітинного метаболізму [210, 373, 383, 384, 386, 433, 452]. Наведені відомості стали теоретичним обґрунтуванням різнобічного експериментального фармакологічного вивчення оригінальних вітчизняних препаратів альтану та елгацину, створених на основі суми елаготанінів, вилучених із суплідь вільхи, а також порівняння їхньої ефективності і механізму дії із відомими флавоноїдними препаратами кверцетином і силібором.
Відповідно до загальноприйнятої методології дослідження нових антиоксидантів [130, 305] початкова оцінка можливого втручання елаготаніновміщуючих препаратів у процес ВРО здійснювалась за допомогою одного із найуживаніших скринінгових методів in vitro у реакційній системі окиснення жовточних ліпопротеїнів [129]. Згаданий метод дає можливість оцінити так звану сумарну протиокисну активність (СПОА) речовин, яка складається з антирадикальної, антиперекисної дії, а також здатності до інактивації небілкових каталізаторів ПОЛ, зокрема іонів двовалентного заліза. Результати зазначених дослідів дозволили констатувати наявність у альтану і елгацину СПОА, близької за вираженістю до значення аналогічного показника кверцетину і силібору - відомих флавоноїдних антиоксидантів, обраних за препарати порівняння. Наведене співпадає з даними літератури про передбачувану антиоксидантну ефективність рослинних дубильних речовин і флавоноїдів, детерміновану їхньою хімічною структурою [8]. Між тим, звертає на себе увагу той факт, що значення ізоефективних концентрацій кверцетину і силібору були суттєво меншими за такі альтану і елгацину. На перший погляд отримані нами результати суперечать з даними літератури про існування прямого корелятивного зв‘язку між антиоксидантною активністю фенольних сполук і кількістю фенольних гідроксильних угрупувань [112, 122, 230, 466, 474]. Оскільки елаготаніни, як представники дубильних речовин, характеризуються більшим значенням (-ОН)n, слід було б очікувати протилежну картину впливу альтану і елгацину на перебіг індукованого ПОЛ, а саме, досягнення ефекту у менших концентраціях, ніж у флавоноїдних препаратів. У нашому випадку пояснення наведених даних можливе з урахуванням антирадикальних потенцій рослинних поліфенолів. Відомо, що здатність до гальмування процесу ПОЛ у цілому визначається не тільки (а іноді і не стільки) антирадикальною активністю речовин, скільки спроможністю новоутвореного радикалу антиоксиданту індукувати зародження нових ланцюгів окиснення. Речовини, здатні утворювати активні радикали, характеризуються більш слабкою АОА, ніж речовини із слабкими радикалами” [26, 122]. Можна припустити, що у діапазоні низьких концентрацій альтану та елгацину першочерговим наслідком втручання елаготанінів у процес ПОЛ є утворення активних радикалів” власне танінів. Останні здатні підтримувати перебіг реакцій ліпопероксидації як прооксиданти і поступово накопичуються у реакційному середовищі за умови підвищення концентрації елаготаніновміщуючих препаратів. При досягненні певної концентраційної межі активні радикали поліфенолів знешкоджуються у реакціях димеризації або за рекомбінантним механізмом, перериваючи таким чином ланцюговий процес ПОЛ:
F˙+ F˙ → F-F - реакція димеризації;
F ˙ + LOO˙ (L˙)→ F-LOO(L) реакція рекомбінації, де
F˙- феноксильний радикал; LOO˙ (L˙) ліпідні радикали;, F-F, F-LOO(L) молекулярні продукти.
З іншого боку, у даній модельній системі, очевидно, треба зважати на склад вихідного субстрату ПОЛ, представленого багатими на білки жовточними ліпопротеїнами. Можна припустити, що внаслідок високої тропності до білків дубильних речовин, обумовленої їхніми фізико-хімічними властивостями [75, 287], за обраних умов відбувається сполучення діючих речовин альтану і елгацину із білковим компонентом ЖЛ. Підвищення концентрації елаготаніновміщуючих препаратів забезпечує збільшення чисельності вільних реакційноздатних молекул, які й зумовлюють антиокиснювальний ефект. На користь цього свідчить динаміка прояву пригнічувального впливу препаратів на процес накопичення продуктів ПОЛ. Поступове зростання СПОА альтану і елгацину відповідає даним літератури про куполоподібну залежність утворення зв‘язку протеїн-танін” від концентрації зазначених компонентів [201]. Тобто, у обраному реакційному середовищі втручання елаготанінів у процес індукованого ПОЛ може починатися при досягненні концентраційного рівня, що перевищує межу насичення під час їхньої взаємодії з білками. Загалом, результати дослідів з визначення СПОА дозволили оцінити вираженість антиоксидантної активності альтану і елгацину як близьку до такої кверцетину і силібору, але при значеннях ІС50, які перевищують аналогічні у референс-препаратів. Треба думати, що флавоноїди, беручи участь у ПОЛ, здатні утворювати власні слабкі радикали” і таким чином стримувати розвиток ланцюгових реакцій вже у малих концентраціях. Діючі складові альтану і елгацину - елаготаніни, як речовини з активними радикалами, витрачаються більш інтенсивно, хоча за кінцевим результатом пригніченням індукованої ліпопероксидації на 50% і вище, згадані оригінальні препарати не поступаються препаратам порівняння на основі флавоноїдів. Підвищене витрачання елаготанінів можна пояснити також їхньою участю у знешкодженні не лише АФК, але й вельми високою спроможністю до знешкодження перекисних радикалів ліпідів [122], які у даному випадку утворюються у процесі ліпопереокиснення жовточних ліпопротеїнів.
Обговорювана участь елаготанінів у реакціях радикалоутворення та інактивації радикальних продуктів може свідчити більшою мірою про їхні прямі антирадикальні властивості. Останнє ствердження вимагало проведення додаткових досліджень з використанням модельних систем генерації вільних радикалів, зокрема кисню, які вважаються провідними чинниками активації і гіперактивації ВРО у біологічних системах [27, 188, 236, 250, 297,343]. Саме з цією метою здійснювалось порівняльне дослідження здатності виучуваних препаратів до безпосередньої інактивації АФК - супероксиданіону (СОА) і гідроксильного радикалу (ОН·).
Аналіз результатів дослідження антирадикальної активності елаготаніновміщуючих препаратів щодо СОА дозволив встановити певну відмінність у характері впливу альтану на процес генерації згаданої АФК в залежності від типу модельної системи. В умовах перетворення адреналін→адренохром” за участю СОА підвищення у середовищі концентрації альтану супроводжувалось поступовим прискоренням зазначеної реакції. На відміну від вищенаведеного у ксантин-ксантиноксидазній” системі пригнічувальний вплив альтану на процес утворення СОА характеризувався високим рівнем вираженості. Тлумачення отриманих результатів потребувало урахування особливостей обраних модельних умов. Відомо, що швидке окиснення адреналіну у сильнолужному середовищі (рН=10) відбувається з утворенням проміжних радикальних продуктів і аніон-радикалу кисню. Наімовірніший механізм гальмування аутоокиснення адреналіну речовинами-відновниками зумовлений видаленням супероксидних аніонів та інших вільнорадикальних сполук із сфери реакції [5]. Прискорення утворення адренохрому при додаванні альтану очевидно обумовлюється додатковою генерацією радикальних продуктів. Підвищенню окиснюваності елаготанінів альтану у сильнолужному середовищі може сприяти вивільнення карбоксильних груп у складі гексаоксидифенової кислоти (додатково до наявних фенольних гідроксилів). Підтвердженням можливості прояву діючими речовинами альтану прооксидантних властивостей виступають численні дані літератури щодо модуляції спрямованості радикальних реакцій поліфенольними сполуками в залежності від умов модельних систем [5, 341, 347]. У нашому випадку сильнолужне середовище сприяє гідролізу альнітанінів альтану та подальшому окисненню продуктів гідролізу за вільнорадикальним механізмом. У дослідах з окиснення ксантину за участю ксантиноксидази близькі до фізіологічних значення рН (рН=7,8) виявилися оптимальними для прояву антирадикальної дії альтану. Аналіз знешкоджувальної дії щодо СОА іншого елаготаніновміщуючого препарату елгацину показав, що вираженість антирадикального ефекту останнього в умовах обох дослідів була помірною і носила сталий характер, проте у значно вищих концентраціях, ніж альтану. Менш виразний, ніж у альтану, але сталий характер антирадикальної активності елгацину щодо СОА, незалежно від умов дослідів, зумовлюється переважно фенольними гідроксильними угрупуваннями та стабільністю структури за рахунок лактонізації.
Оцінюючи антисупероксидрадикальну активність флавоноїдних референс-препаратів в умовах моделі адреналін-адренохром” слід відзначити певну перевагу кверцетину за виразністю ефекту і за значенням максимально ефективної концентрації порівняно з елаготаніновміщуючими препаратами. Зазначений антирадикальний ефект кверцетину в описаних умовах підтверджує відомі дані літератури [53, 73, 162]. Пригнічення силібором реакції аутоокиснення адреналіну у концентрації, близькій до концентрації кверцетину, було незначним. При відтворенні процесу генерації СОА за участю ферменту ксантиноксидази кверцетин і силібор однаково несуттєво гальмували перебіг зазначеної ферментативної реакції, до того ж лише у діапазоні дуже низьких концентрацій. Отже, пригнічення флавоноїдвміщуючими референс-препаратами, особливо кверцетином, процесу генерації СОА більш очевидне при високих значеннях рН. Наведене співпадає з даними H. Hotta, (2001), отриманими під час дослідження окисно-відновних властивостей поліфенольних сполук, зокрема флавоноїдів, за допомогою методів електрохімічного аналізу (струменевого колоночного електролізу і циклічної вольтметрії). Автором встановлено, що кількість електронів, втягнених у окиснення (n-values) поліфенольних сполук перебільшує чисельність наявних ОН-угрупувань у їхній молекулі. Для сполук, які містять дві ОН-групи, n-values становило >2 при рН>7 і досягало 4 при рН=10. Для поліфенолів з більшою кількістю гідроксильних груп у молекулі така закономірність спостерігалась в усьому діапазоні рН (4<рН<10). На основі даних додаткового вольтметричного аналізу висловлене припущення, що при високих значеннях рН може мати місце окисна полімерізація сполук, внаслідок якої окиснені ОН-групи відновлюються у складі полімерних продуктів і знову залучаються до процесу окиснення [463]. Наведеними особливостями реакційної поведінки поліфенольних сполук пояснюється підвищення їхньої радикальної сквенджерної активності при рН=10 , що у наших дослідах показано на прикладі кверцетину. Між тим, у системі ксантин-ксантиоксидаза” (при рН=7,8) антирадикальна активність як кверцетину, так і силібору, на відміну від альтану і елгацину, швидко втрачала лінійний характер у дуже вузькому діапазоні концентрацій. Вищенаведене дозволило зробити висновок про перевагу препаратів на основі елаготанінів як антиоксидантівінактиваторів супероксидного радикалу в умовах, близьких до фізіологічних, як за ефективністю так і безпечністю з урахуванням значень діючих концентрацій.
Продовжуючи вивчення антирадикальної активності нових елаготаніновміщуючих антиоксидантів ми зосередили увагу на з‘ясуванні їхнього втручання у процес генерації та знешкодження таких АФК як гідроксильних радикалів. З сучасних поглядів на значимість АФК у розвитку та перебігу ВРО обговорюється висока цитотоксичність не стільки супероксиданіону, скільки іншого продукту неповної редукції кисню - гідроксильного радикалу. До того ж, знешкоджувальна дія речовин відносно СОА не визначає наявності аналогічного впливу на ОН-радикал і навпаки [308]. Зазначене визначило необхідність дослідження антирадикальної активності елаготаніновміщуючих препаратів щодо гідроксильного радикалу. У наших дослідах показано, що альтан і елгацин справляли виражений пригнічувальний вплив на процес утворення ОН-радикалів, перевершуючи ефективність флавоноїдних препаратів кверцетину і силібору за значеннями ефективних концентрацій. Звертає на себе увагу, що у обраній системі окиснення дезоксирибози ОН-радикалами, які генеруються у модельній реакції Фентона, антирадикальна дія усіх виучуваних рослинних препаратів виявляється у більших концентраціях, ніж у вищеописаних дослідах з інактивації супероксиданіону. Можна припустити часткове залучення діючих речовин елаготаніновміщуючих і флавоноїдних препаратів до комплексування з іонами двовалентного заліза, проте в умовах даного досліду Fe2+ вводиться до реакційного середовища у вигляді стійкого комплексу з ЕДТА. У такому разі підвищене витрачання поліфенольних сполук у реакціях знешкодження ОН-радикалу можна пояснити надзвичайно високою агресивністю згаданої АФК, порівняно з іншими радикальними метаболітами кисню [188]. Виходячи з цього припущення та орієнтуючись на ефективні концентрації альтану і елгацину, порівняно з кверцетином і силібором, можна зробити висновок про виразнішу здатність елаготанінів до інактивації ОН-радикалів, яка опосередковується відомою зумовленістю антирадикальних потенцій поліфенольних сполук насамперед кількістю фенольних гідроксилів. На користь зазначеного свідчило порівняння значень С50% елаготаніновміщуючих препаратів і флавоноїдних референс-препаратів з манітом - стандартною пасткою” ОН-радикалу [381, 417]. За значенням С50% антирадикальний ефект альтану і елгацину перевищував такий маніту у 5 разів і 2,2 рази, відповідно, у той час як співвідношення С50% кверцетин/маніт відрізнялось - у 1,5 рази, силібор/маніт у 1,8 рази. Очевидна перевага альтану порівняно з іншими виучуваними препаратами за результатами наведеної серії дослідів може забезпечуватись, як вже зазначалось вище, не лише наявністю фенольних гідроксильних груп, але й вивільненням карбоксильних груп гексагідроксидифенової кислоти, яка є агліконом альнітанінів.
Таким чином, дані вищенаведеного фрагменту досліджень дозволили аргументовано зробити висновок про наявність вираженого гальмівного впливу елаготаніновміщуючих препаратів на процес генерації окремих АФК, зокрема СОА і ОН-радикалу, та визначити перевагу їхньої прямої антирадикальної дії порівняно з флавоноїдними антиоксидантами. Між тим, існування різноманітних потенційних джерел утворення АФК у організмі дозволяє обговорювати не лише пряму (сквенджерну), але й опосередковану антирадикальну активність інгібіторів ВРО. З цієї точки зору представляло інтерес дослідити можливий регуляторний вплив елаготаніновміщуючих препаратів на процеси, які є постачальниками АФК у організмі. Так, утворення гідроксильних радикалів у біологічних системах найчастіше спряжене з реакцією Фентона розщеплення пероксиду водню у присутності іонів двовалентного заліза:
Fe2+ + H2O2 →Fe3+ +ОНֿ + ОН˙
Саме каталітичній активності іонів заліза надається провідне значення у процесі вивільнення ОН˙ [26, 48, 157, 188, 306, 417]. До того ж присутність Fe2+ обов’язкова в усіх системах утворення cупероксиданіонів з О2 у організмі людини. Окиснення іонів двовалентного заліза молекулярним киснем ініціює ланцюговий процес ліпопереокиснення, продуктами якого є реакційноздатні радикали жирних кислот (L˙), ліпоперекиси (LО2˙), гідроперекиси (LООН). Іонізоване залізо каталізує розпад гідроперекисів ліпідів з утворенням реактивних алкоксильних радикалів (LО˙), які можуть брати участь у залученні до ПОЛ нових молекул ненасичених жирних кислот, тобто у розгалуженні ланцюгів вільнорадикального окиснення [27, 65, 306, 396]. Прооксидантний ефект заліза залежить від його концентрації у середовищі, ступеню окисненості та стану іонів (вільний чи сполучений). Каталітична активність заліза як активатора реакцій вільнорадикального характеру встановлена для іонів Fe2+ у низьких концентраціях (10-3 М), у більш високих концентраціях іони Fe2+ реагують не лише з гідроперекисами ліпідів, але й з вільними радикалами, тобто виступають у ролі інгібіторів вільнорадикальних процесів. Доведено, що відновлювачі заліза або його хелатори справляють дозозалежний модулюючий вплив на стан ПОЛ, прискорюючи чи гальмуючи швидкість перебігу реакцій ліпопереокиснення. Наведене стало теоретичним підгрунтям дослідження впливу елаготаніновміщуючих препаратів альтану і елгацину на каталітичну активність Fe2+ у порівнянні з флавоноїдними препаратами кверцетином і силібором. Найвиразніша здатність до хелатування іонів двовалентного заліза встановлена для альтану і підтверджувалась явищем повної блокади ПОЛ з підвищенням концентрації препарату у реакційному середовищі. Останнє, як відомо, опосередковується, насамперед, інактивацією каталізатора згаданого біохімічного процесу [306, 396, 417]. Хелатувальна спроможність елгацину у порівняних з альтаном концентраціях була дещо менш вираженою, хоча за характером (прямо дозозалежним) наближалась до нього. Треба думати, що більш інтенсивне зменшення концентрації екзогенного заліза у реакційному середовищі в присутності альтану зумовлюється хімічними властивостями функціональних груп його діючих речовин - альнітанінів. Схильність фенольних гідроксилів до комплексоутворення з Fe2+ може поєднуватися з утворенням солей заліза за рахунок карбоксильних груп у складі гексагідроксидифенової кислоти, що забезпечує більш інтенсивне вилучення каталізатору. З іншого боку, обговорювана у попередніх дослідах окисно-відновна агресивність” альтану може сприяти окисненню заліза до менш реакційноздатної форми Fe3+ і таким чином також стримувати індукцію ПОЛ. У складі елгацину основний діючий компонент елагова кислота, яка є лактоном гексагідроксидифенової кислоти, може брати участь у реакції хелатування із залізом лише завдяки вільним фенольним гідроксилам, що позначається певним послабленням досліджуваної властивості порівняно з альтаном. Порівняний з елгацином вплив кверцетинуна концентрацію екзогенного заліза також можна обговорювати відповідно до наведеного, оскільки функціональними угрупуваннями молекули кверцетину є фенольні гідроксили. Відсутність будь-яких ознак впливу референс-препарату силібору на пускові механізми ліпопероксидації в умовах аналогічних дослідів і у співставлених з іншими виучуваними препаратами концентраціях виступає свідченням хімічної інертності флаволігнанів відносно реакції комплексоутворення. Між тим, втручання силібору у перебіг аскорбатзалежного ПОЛ виявлялось вірогідно розбіжним із контрольними значеннями зменшенням накопичення у реакційному середовищі продуктів ліпопероксидації як прояв його прямих антиоксидантних властивостей. Аналогічне явище зареєстроване також при дослідженні альтану, елгацину і кверцетину у певних концентраціях, що підкреслює поєднання у антиоксидантній дії останніх здатності до інактивації каталізаторів ПОЛ - іонів двовалентного заліза та прямої антирадикальної дії.
Продовжуючи огляд потенційних джерел АФК у живому організмі слід відзначити безперечний внесок у розвиток окисного стресу” ферментативних процесів, які належать до складу, так званої, прооксидантної системи” [52, 287, 297, 343, 433]. Оскільки досить широко обговорюється, зокрема, антиксантиноксидазна та антиліпооксигеназна активність рослинних поліфенольних сполук [90, 265, 272, 273, 287], представляло інтерес провести вивчення механізму дії альтану та елгацину у згаданому спрямуванні та порівняти виразність ефекту з флавоноїдними референс-препаратами. З іншого боку, представлене дослідження дозволяє відмежувати у механізмі антирадикальної дії рослинних препаратів внесок сквенджерної (прямої антирадикальної) і опосередкованої (через інгібіцію прооксидантних ферментів) активності. Тому при оцінці впливу елаготаніновміщуючих і флавоноїдних референс-препаратів на активність ферменту ксантиноксидази (КО) in vitro ми враховували вищенаведені результати дослідження антисупероксидрадикального ефекту у аналогічній системі ксантин-ксантиноксидаза”. Узагальнення отриманих результатів дозволило заключити, що у механізмі антирадикальної дії альтану вагоме місце посідає сквенджерна активність щодо СОА, яка доповнюється помірною дозозалежною антиксантиноксидазною активністю. У елгацину, навпаки, здатність до пригнічення СОА-продукції опосередкована гальмівним впливом на СОА-генеруючу ферментативну систему, хоча з підвищенням концентрації препарату посилюється сквенджерна активність. Наведене співпадає з даними літератури про антиксантиноксидазну активність елагової кислоти, яка є переважаючим компонентом елгацину. Треба думати, що глікозидний тип будови альнітанінів альтану позначається послабленням здатності до взаємодії з ферментативним білком і таким чином зменшує ступінь інгібіції ксантиноксидази. Характерним у дії флавоноїдних препаратів було поєднання вираженої спроможності до інгібіції ферменту з невиразним антирадикальним ефектом у аналогічній модельній системі, що дозволяє обговорювати непрямий механізм знешкодження СОА. До того ж, порядок та діапазон досліджуваних значень ефективних концентрацій кверцетину і силібору, значно менший за такий альтану і елгацину, свідчить про більшу широту представленої специфічної дії елаготанінів.
Зважаючи на важливу роль лейкотрієнів у формуванні проявів оксидативного стресу”, а також на посилення процесу генерації АФК при активації ліпооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти [187, 374, 477], у наших дослідах проведене орієнтовне визначення антиліпооксигеназної активності елаготаніновміщуючих препаратів альтану і елгацину порівняно з флавоноїдними препаратами кверцетином та силібором. Обрані з цією метою моделі запальних патологій відтворювались за допомогою флогогенів полісахаридної будови (зимозан, декстран), механізм дії яких реалізується через підвищення судинної проникності, виразне посилення лейкоцитарної реакції дихального вибуху”, а, отже, активацію ліпооксигеназного відгалуження метаболізму ейкозаноїдів, насамперед, у клітинах крові. Особливістю дії декстрану як ад‘юванту запалення є здатність за тимуснезалежним механізмом індукувати синтез антитіл В-лімфоцитами, серед яких у розвитку запальних та алергійних реакцій провідна роль належить імуноглобуліну Е. Останній сполучається з рецепторами мембрани гладких клітин, базофільних гранулоцитів і при наступному комплексуванні з антигеном спричиняє їхню дегрануляцію та вивільнення гістаміну. До того ж імуноглобуліни Е, як і антигенна субстанція бактеріального походження зимозан, беруть участь у альтернативному шляху активації системи комплементу, що вважається необхідною умовою реалізації не лише імунної відповіді, але й, за певних умов, цитотоксичності. Відомо також, що зимозан безпосередньо активує гранулоцити периферійної крові та тканинні макрофаги, таким чином провокуючи локальну запальну реакцію і інтенсифікацію виділення СОА [35].
На підставі даних, отриманих у дослідах з відтворенням моделей зимозанового та декстранового запалень, можна зробити висновок, що як альтан, так і елгацин виявляють здатність до специфічного пригнічення лейкотрієнзумовлених патологій, за вираженістю порівняну з такою флавоноїдного препарату кверцетину. До того ж виучуваний ефект альтану і елгацину виявлявся при їхньому застосуванні у дозі 1 мг/кг, а кверцетину - у дозі 5 мг/кг. Протизапальний ефект силібору у дозі 25 мг/кг сумарно оцінювався як помірно виразний. Міркування про антиліпооксигеназну активність оригінальних елаготаніновміщуючих препаратів доречні, оскільки спираються на дані сучасної літератури про зумовленість антилейкотрієновим механізмом прояву багатьох біологічних ефектів кверцетину, обраного у наших дослідах за референс-препарат [73, 135]. Ця властивість встановлена також для інших природних фенольних сполук флавоноїдів, кумаринів, катехоламінів [8, 13, 75, 113, 287, 426], а у наших дослідах визначена для силібору, який містить суму конденсованих флавоноїдних сполук флаволігнанів. Попри зазначене, в умовах зимозанового запалення альтан дещо помірніше за кверцетин справляв інгібіторну дію на розвиток другої стадії зимозанового набряку (4-а година спостереження). Наведене пояснюється відомими молекулярними механізмами, які зумовлюють формування зимозанового набряку. Початкова стадія останнього опосередковується переважно дією лейкотрієнів, а на другому етапі запалення вивільнюються інші прозапальні фактори кініни, гістамін, серотонін тощо та інтенсифікується ПОЛ [300]. Визначена у протизапальній дії альтану тенденція до пригнічення зимозанового набряку на пізній стадії може бути відзеркаленням антикініногенового ефекту, притаманного елаготанінам [8], а також інгібіторним впливом на процес ПОЛ. Проводячи аналогію з кверцетином за динамікою та вираженістю впливу на розвиток модельних запальних патологій можна підсумувати, що наявність антиліпооксигеназного механізму є складовою механізму антиоксидантної дії оригінальних елаготаніновміщуючих препаратів і виявляється у дозах, менших за ізоефективну у кверцетину.
Наступний фрагмент наших досліджень стосовно впливу елаготаніновміщуючих препаратів на функціональний стан ферментативних систем , які забезпечують неспецифічну резистентність клітин організму щодо аномального ВРО, торкався активності глутатіонзалежного поліферментатного комплексу. Відомо, що прогресування процесу ВРО у організмі зумовлюється першочерговим накопиченням вільнорадикальних метаболітів кисню (АФК), а надалі - радикалів органічного походження, які з‘являються під час переокиснення ліпідних субстратів. Система біологічного захисту від гідроперекисів ненасичених жирних кислот (АГП) забезпечується комбінованою дією ферментів фосфоліпази А2 та глутатіонвміщуючого ферменту глутатіонпероксидази (ГПО). Завдяки фосфоліпазі А2 відбувається вилучення ацилгідроперекисів із складу мембранних фосфоліпідів та подальший вихід з ліпідного шару мембран для подальшої утилізації. У цитозолі глутатіонпероксидаза відновлює ацилгідроперекиси до спиртів за рахунок окиснення глутатіону. Регенерація глутатіону у складі ГПО відбувається за участю ферменту глутатіонредуктази (ГР), яка використовує атоми водню від НАДФН-глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФД). Глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза та глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа функціонують як поліферментний комплекс у так званому глутатіоновому редокс-циклі [87, 97]. Значимість ГПО, як другої лінії ферментативної АОС, підкреслюється також участю у знешкоджені пероксиду водню [151, 339, 362, 421]. Оскільки відновлений глутатіон є донором електронів і активним центром ГПО, його присутність у клітині вважається обов‘язковою умовою реактивації ферменту. Окремий внесок у антиоксидантний ферментативний захист належить ще одному глутатіонзалежному ферменту глутатіон-S-трансферазі (ГТ), яка не лише інактивує ліпоперекиси, але й бере участь у знешкодженні вторинних продуктів пероксидації шляхом глутатіонової кон‘югації [339]. Відомо, що еубіотики та ксенобіотики можуть справляти безпосередній модулюючий вплив на активність антиоксидантних глутатіонових ферментів, а також вилучати із середовища субстрати та продукти ферментативної реакції, змінюючи таким чином її спрямованість та рівновагу. Дотримуючись наведеної точки зору у завдання нашого дослідження входило з‘ясування регулюючого впливу альтану і елгацину на активність ферментів глутатіонового редокс-циклу та глутатіон-S-трансферази за умови модельної вільнорадикальної патології і співставлення особливостей дії з такою у флавоноїдних препаратів кверцетину і силібору. У наших дослідах за умови гострої інтоксикації білих щурів тетрахлорметаном, яка відтворює явища оксидативного стресу”, відбувалось різке пригнічення сумарної глутатіонпероксидазної активності у печінці щурів з групи контрольної патології виключно за рахунок інактивації селеннезалежного ізоферменту ГПО, практично не торкаючись активності селензалежного ізоферменту. Для пояснення зазначеної картини змін треба згадати субстратну специфічність відомих ізоформ ГПО.Відомо, що ГПО-1 бере участь переважно у відновленні пероксиду водню і меншою мірою у відновленні АГП ненасичених жирних кислот. ГПО-ІІ каталізує відновлення органічних перекисів (АГП, гідроперекисів стероїдів, у т.ч. холестерину), тому її ще називають ліпопероксидазою [362]. Оскільки ГПО-І включається у ПОЛ на етапі ініціювання АФК, можливі конкурентні взаємовідносини між згаданим ферментом і каталазою [12, 87]. У даному випадку внесок каталази у дезактивацію АФК (пероксиду водню) є більш потужним, що й стримує витрачання ГПО-І. До того ж відомо, що ГПО ефективна при малих концентраціях перекису водню, каталаза при високих [59]. На підтвердження зазначеного, високий рівень інтенсивності ВРО в умовах представленого досліду підкреслювався зменшенням активності ГПО-ІІ і ГТ, дія яких спрямована на розщеплення АГП, а також ферментів рециклювання глутатіону глутатіонредуктази та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази. Наведена ензимологічна картина є свідченням значного виснаження пулу відновленого глутатіону, яке може мати місце за умови надмірного використання у реакціях ВРО та, з іншого боку, внаслідок зрушення шляхів його редукції [94, 159, 421].
Під впливом альтану нормалізація функціонування глутатіонзалежних ферментів відзеркалювалась насамперед відновленням активності селеннезалежного ізоферменту у складі сумарної ГПО-активності та виразною тенденцією до протекції ГТ. Очевидно, завдяки вираженій антирадикальній активності щодо АФК і ліпідних перекисів та здатності до інактивації каталазаторів ПОЛ діючі речовини альтану запобігають ініціації механізмів, відповідальних за утворення пероксиду водню і ліпоперекисів субстратів ГПО і ГТ. Поряд із зазначеним, захисний вплив альтану практично не позначився на функціональному стані глутатіонвідновлюючих ферментів - ГР і Г6ФД. Елгацин, навпаки, показав чітко окреслену здатність до нормалізації функції ГР і Г6ФД, не справляючи коригуючого впливу на активність антипероксидних ферментів ГПО і ГТ. Отже, дія елгацину найбільш наочно пов‘язана з функціонуванням ферментів, які забезпечують відновлення глутатіону. За характером модулюючого впливу на активність глутатіонзалежних ферментів флавоноїдний референс-препарат силібор наближався до елгацину, а відновлюючий потенціал кверцетину позначився більшою мірою на рівні Г6ФД та дещо менше стосувався глутатіонпероксидазної активності. Останнє, очевидно, знаходиться у прямій залежності від вираженості антирадикальних властивостей зазначеного флавоноїду (по аналогії з альтаном). Треба думати, що діючі речовини як елгацину, так і обраних флавоноїдних препаратів першочергово використовуються як донатори водню для НАДФН-залежних ферментних систем, що співпадає з даними літературних джерел [159]. Відомо, що ключовою реакцією у метаболізмі глутатіону є відновлення його окисненої форми, яке відбувається за участю глутатіонредуктази. За умови виконання дезактивуючої ролі ВГ щодо АФК та ліпоперекисів саме цей шлях вважається біологічно вигідним, оскільки швидкість його значно вища за швидкість синтезу глутатіону de novo. При наявності відновлених субстратів має місце перенесення атомів водню за участю ланцюжка: НАДФН-дегідрогенази →ГР→ВГ→окиснені субстрати [96, 159]. Відсутність у клітині достатньої кількості НАДФН може бути лімітуючим фактором відновлення пероксиду водню і ацилгідроперекисів і, як наслідок, спричиняти інтенсифікацію ПОЛ. Рослинні поліфеноли розглядаються як потенційні відновлюючі еквіваленти, що забезпечують глутатіоновий гомеостаз за рахунок рухомих атомів водню у складі фенольних гідроксилів. Виключенням у нашому випадку виступає альтан, хімічна будова альнітанінів якого визначає участь насамперед у реакціях одноелектронного відновлення радикальних продуктів, а не протондонорні властивості як елгацину та флавоноїдів.
Доведений у наших дослідах різнобічний модулюючий вплив елаготаніновміщуючих препаратів на перебіг ВРО підсумково спрямовується на захист найвразливішого субстрату неконтрольованого ВРО мембранних фосфоліпідів. Процес вільнорадикального окиснення вважається одним із найсильніших модифікаторів мембран і охоплює обидва її компоненти як ліпідний бішар, так і білки. Відомо, що за умови аномального ПОЛ, яке неодмінно супроводжується виснаженням фізіологічної антиоксидантної системи організму (АОС), відбувається перебудова ліпідного бішару мембранних утворень, збільшення у поверхневому шарі вмісту насичених жирних кислот, холестерину, має місце фракціонний перерозподіл фосфоліпідів. Означене безпосередньо впливає на параметри динамічної структури біомембран (мікров‘язкість, плинність), які зумовлюються взаємодією як ліпідних, так й неліпідних, перш за все білкових, компонентів. Модулювання структурного захисту мембрани, яке має м