Лавриненко Вікторія Євгенівна Біологічний вплив вуглецевих матеріалів різної дисперсності на курячі ембрі­они

brief description

Лавриненко Вікторія Євгенівна, старший лаборант ка­федри гістології та ембріології Національного медичного університету імені О. О. Богомольця: «Біологічний вплив вуглецевих матеріалів різної дисперсності на курячі ембрі­они» (03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія). Спецрада Д 26.001.38 у Київському національному універ­ситеті імені Тараса Шевченка

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
На правах рукопису
Лавриненко Вікторія Євгенівна
УДК 591.3:598.6:546.26
БІОЛОГІЧНИЙ ВПЛИВ ВУГЛЕЦЕВИХ МАТЕРІАЛІВ РІЗНОЇ
ДИСПЕРСНОСТІ НА КУРЯЧІ ЕМБРІОНИ
03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Науковий керівник:
завідувач кафедри гістології та ембріології
НМУ імені О.О. Богомольця,
член-кор. НАМН України, д.м.н., професор
Чайковський Юрій Богданович
Київ – 2016
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ………………………………………............4
ВСТУП……………………………………...…………………..………………............5
РОЗДІЛ 1 ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ…………………………….………..……..........11
1.1. Дані про вплив вугілля різної дисперсності на живі системи………..…..........11
1.1.1. Дані щодо біологічних ефектів активованого вугілля.....................................11
1.1.2. Дані щодо біологічних ефектів технічного вугілля.........................................13
1.1.3. Дані щодо біологічних ефектів алмазних наночасточок.................................17
1.1.4. Дані щодо біологічних ефектів терморозширеного графіту...........................23
1.2. Закономірності ембріогенезу курки………………………………...…...............24
1.3. Узагальнення даних літератури та обґрунтування напрямку досліджень........30
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ…………….….............32
2.1. Об’єкти дослідження..............................................................................................32
2.2. Досліджувані матеріали.........................................................................................34
2.3. Методики макроскопічних досліджень................................................................35
2.4. Методики гістологічних досліджень....................................................................37
2.5. Методики електронно-мікроскопічних досліджень............................................37
РОЗДІЛ 3 РЕЗУЛЬТАТИ МАКРОСКОПІЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ……............39
3.1. Опис стану зародків з експериментальних груп та їх провізорних органів.....39
3.2. Результати статистичної обробки макроскопічних показників
ембріогенезу………………………………………………………………..…............46
РОЗДІЛ 4 РЕЗУЛЬТАТИ ГІСТОЛОГІЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ…………..........52
4.1. Результати дослідження контрольної групи…………………………...............52
4.2. Результати дослідження групи із введеним активованим вугіллям……..........56
4.3. Результати дослідження групи із введеним технічним вугіллям………..........61
4.4. Результати дослідження групи із введеними алмазними
наночасточками…………………………………………………………...…..............71
4.5. Результати дослідження групи із введеним терморозширеним
графітом………………………………………………………………………..............77
3
4.6. Результати статистичної обробки даних площі епітелію ниркових канальців
контрольної та експериментальних груп……………………..……………..............82
РОЗДІЛ 5 РЕЗУЛЬТАТИ ЕЛЕКТРОННОМІКРОСКОПІЧНИХ
ДОСЛІДЖЕНЬ…………………………………………………………..…...............85
5.1. Результати дослідження контрольної групи……………………….……...........85
5.2. Результати дослідження групи із введеним активованим вугіллям……..........94
5.3. Результати дослідження групи із введеним технічним вугіллям……............103
5.4. Результати дослідження групи із введеними алмазними
наночасточками……………………………………………………….…..................109
5.5. Результати дослідження групи із введеним терморозширеним
графітом…………………………………………………………………..…..............116
РОЗДІЛ 6 РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ…...........121
ВИСНОВКИ………………………………………………………….……..............137
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ………………………………...............139
4
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АВ – активоване вугілля
АНЧ – алмазні наночасточки
ГЕПС – гранулярна ендоплазматична сітка
ЕГ – експериментальна група
ЖМ – жовтковий мішок
ІГ – інтактна група
КГ – контрольна група
РСВ – респіраторно-синцитіальний вірус
ТВ – технічне вугілля, сажа
ТРГ – терморозширений графіт
ХОЗЛ – хронічні обструктивні захворювання легень
ЧА – часточки аерозолів
ШКТ – шунково-кишковий тракт
TNF-α - фактор некрозу пухлин
IL - інтерлейкін
5
ВСТУП
Актуальність обраної теми дослідження. Зростаючий інтерес до
застосування вуглецевих наноматеріалів у медицині не викликає сумнівів.
Препарати на основі вуглецевих наноматеріалів широко використовуються для
лікування пухлин, адресної доставки ліків та візуалізації певних структур у
тканинах [1–10]. На жаль, незважаючи на значну кількість, дослідження
токсичності наноматеріалів не стандартизовані, через що важко встановлювати
зв'язок між отриманими результатами та будовою, розмірністю різних матеріалів,
їхніми біологічними ефектами [11]. Крім того, тератогенний ефект вуглецевих
наночасточок лишається практично недослідженим.
Загалом вважається, що активоване вугілля (АВ) не здатне проникати у
тканини організму і абсолютно інтактне, тому з давніх часів використовується в
медицині [12, 13]. Проте технологія приготування АВ, котра передбачає вплив
високих температур, може супроводжуватись утворенням дрібних часточок з
великою проникною здатністю, зокрема — нанорозмірних [14].
Аналогічною є ситуація з терморозширеним графітом (ТРГ), що переважно
використовується у промисловості і лише опосередковано – в медицині (матриця
для синтезу нанотрубок) [15], адже для розширення просторів у кристалічній
решітці природно-кристалічного графіту використовують хімічні сполуки і
високу температуру [16].
Більшість досліджень патологічних ефектів технічного вугілля (сажі) (ТВ)
стосується потенційних ризиків для здоров'я при згоранні дизельного палива та
фабричних емісій, де міститься велика кількість інших речовин [17–33]. До того
ж, практично невисвітленим на сьогоднішній день лишилось питання впливу сажі
на різні системи організму, бо основну увагу дослідники зосереджують на легенях
та шкірі [11, 34–38]. Значна частина авторів, що заперечують патогенну дію сажі
на живі організми, спирається на фрагментарне сприйняття її властивостей:
оскільки сажа майже повністю складається з карбону, вона ніяким чином не
включається в метаболізм і після інгаляції з часом просто виводиться з організму
6
за допомогою мукоциліарного транспорту. Вочевидь така інтерпретація
біологічних ефектів сажі не зовсім коректна.
Все більшу увагу промисловості, пов'язаної з наноматеріалами,
привертають розробки алмазних наночасточок (АНЧ). Вони наділені унікальними
характеристиками – біосумісністю, низькою хімічною реактивністю, оптичною
прозорістю, надзвичайною міцністю тощо. Сучасні публікації все частіше
описують різноманітні дивовижні властивості і шляхи їх застосування: в якості
біосенсорів, переносників ліків, засобів візуалізації певних структур чи
імобілізації білків [1–6, 39]. Розуміння базових принципів і особливостей впливу
цих структур на живі організми, оцінка можливих ризиків їх використання є
абсолютно необхідними для їх подальшого медичного і біологічного
застосування. Тим не менш, наукових досліджень на цю тему в рази менше ніж
тих, що описують все нові і нові потенційні сфери застосування АНЧ.
Незважаючи на наявність різноманітних досліджень біологічного впливу
вуглецевих матеріалів їх тератогенний ефект лишається практично
недослідженим.
Використання різних типів вуглецевих наночасточок у медицині зараз
перебуває на роздоріжжі між перевіркою їх біологічних властивостей і
застосуванням для лікувальних та діагностичних програм [40–44]. Прогрес у
клінічних випробуваннях буде залежати від підсумків токсикологічних
досліджень та результатів вивчення ефективності, що уможливить оптимальне
співвідношення ризиків і користі використання цих структур людиною [45-48].
Усе вищесказане обумовило вибір теми та матеріалів дослідження, адже
саме стандартизований підхід до оцінки впливу вугілля різної дисперсності
уможливить встановлення взаємозв’язків між будовою та біологічними ефектами
цих речовин.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконана в рамках науково-дослідної теми кафедри
гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О.
7
Богомольця «Органи нервової, імунної та сечостатевої систем в умовах
експериментального пошкодження» № д/р 0112U001413 (2011-2015 рр.).
Мета і завдання дослідження – визначення впливу вуглецевих матеріалів
різної дисперсності на організм, що розвивається, та оцінка проникної здатності і
тропності до тканин.
Досягнення мети передбачало вирішення наступних завдань:
1. Встановити вплив вуглецевих матеріалів різної дисперсності на розвиток
курячих ембріонів на макроскопічному рівні.
2. Оцінити вплив вуглецевих матеріалів різної дисперсності на структурні
компоненти зародків курей протягом усіх етапів ембріогенезу на
клітинному та субклітинному рівнях.
3. З’ясувати спроможність та встановити шляхи переміщення досліджуваних
матеріалів в живому організмі, їх тропність до різних тканин.
4. Встановити здатність вуглецевих матеріалів різної дисперсності
проходити крізь стінки кровоносних судин, проникати в тканини і
клітини.
5. Оцінити вірогідність тератогенних ефектів досліджуваних матеріалів.
Об'єкт дослідження — вплив вуглецевих матеріалів різної дисперсності на
живі організми.
Предмет дослідження — біологічні ефекти вуглецевих матеріалів різної
дисперсності щодо організмів, які розвиваються.
Методи дослідження: у роботі використовували макроскопічні, оглядові
гістологічні, електронно-мікроскопічні методи та морфометрію з подальшим
статистичним аналізом результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше морфологічно
верифіковано біологічні ефекти вуглецевих часточок різної дисперсності щодо
структурних компонентів організму на різних етапах ембріонального розвитку.
Одержано дані щодо шляхів поширення досліджуваних матеріалів в
організмі та проникної здатності кожного матеріалу щодо тканин і клітин.
8
Вперше продемонстровано здатність АВ до проникнення в тканини та розширено
дані щодо здатності АНЧ проникати у внутрішньоклітинні структури.
Встановлено відсутність тропності вуглецевих наночасточок до певних
органів чи структур.
Розширено розуміння механізмів патологічних процесів, спричинених
карбоновими часточками в організмі. Вперше встановлено ушкоджуючу дію сажі
щодо кровоносної системи зародка. Підтверджено і розширено дані щодо
спричинення АНЧ оксидативного стресу в клітинах. Продемонстровано тяжкий
тератогенний ефект ТРГ.
Практичне значення. Продемонстровано необхідність дотримання заходів
безпеки для довкілля та особистого захисту на виробництвах, пов’язаних з
технічним вугіллям, алмазними наночасточками та терморозширеним графітом у
зв’язку з їх здатністю проникати до кровоносного русла, мігрувати в організмі та
викликати порушення структури і роботи органів.
Розширення інформаційних даних щодо перебігу ембріогенезу у птахів
надає можливість їх використання в учбовому процесі для розробки посібників,
підготовки лекційних та семінарських занять з гістології та біології розвитку.
Одержані морфологічні підтвердження присутності нанорозмірних вуглецевих
матеріалів в тканинах і клітинах зародків можна використовувати в якості
критерію верифікації цих частинок на гістологічних препаратах.
Використання курячих ембріонів в дослідженні демонструє широкі
можливості застосування цього об’єкта в якості тестової системи для оцінки
патологічної дії різноманітних біологічних (віруси, бактерії) та абіогенних
факторів на цілісний організм.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проведено аналіз
профільної наукової літератури та обґрунтування методології проведення
експерименту. Самостійно було здійснено збір макроскопічних та
морфометричних даних, що характеризують ембріональний розвиток та
проведено їх статистичний аналіз. Здобувач брав участь у всіх етапах
виготовлення препаратів для світлооптичного та ультраструктурного
9
дослідження. Дисертантом було проведено дослідження та опис всіх одержаних
препаратів. Самостійно здійснено аналіз одержаних даних, написані і
проілюстровані всі розділи дисертації та її висновки.
Комплексне лабораторне забезпечення досліджень здійснено на кафедрі
гістології та ембріології НМУ імені О.О. Богомольця. Консультування щодо
виготовлення препаратів для світлової та трансмісійної мікроскопії здійснювали
старші лаборанти Гребенщикова Н.О. та Вішнєвська Н.В. Професором Терещенко
В.П. визначено актуальність наукового пошуку, мету й завдання роботи,
розроблено методологію дослідження, професором Чайковським Ю.Б. проведено
наукове консультування кожного етапу виконання дисертації. Всі дані, отримані у
співавторстві, відображені у спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
доповідались та обговорювались на конференції молодих науковців Інституту
сорбції та проблем ендоекології НАН України (Київ, 2009), ІХ науковій
конференції студентів та молодих науковців в Україні (Київ, 2009), науковопрактичній конференції «YouthNanoBioTech-2010. Молодіжний форум з
нанотехнологій» (Київ, 2010), науково-практичній конференції «Актуальні
питання сучасної патоморфології» (Київ, 2012), ІХ конгресі патологів України
«Актуальні проблеми патології» (Луганськ, 2013).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 наукових праць, з яких 5
наукових статей у фахових виданнях, що відповідають вимогам МОН України, з
яких 2 у наукових виданнях інших держав, що індексуються міжнародними
наукометричними базами; а також одна стаття в збірнику наукових праць; одна
стаття в періодичному (медичному) виданні; 3 тез доповідей у матеріалах
наукових конференцій та конгресах.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, методів досліджень, 3-х розділів результатів власних досліджень,
розділу, присвяченому аналізу й узагальненню результатів, висновків та списку
використаних джерел, який складається з 118 найменувань. Матеріали
дисертаційної роботи викладені на 150 сторінках (з яких основна частина займає
10
139 сторінок, ілюстрована 8 таблицями, 18 рисунками, з них 6 діаграм, 55
мікрофотографіями та 75 електронограмами.

bibliography

ВИСНОВКИ
Вирішена актуальна наукова задача, що полягає у визначенні впливу
вуглецевих матеріалів різної дисперсності на організм, що розвивається, з
оцінкою проникної здатності і тропності до тканин. На основі даних власних
експериментальних досліджень виявлено особливості розповсюдження різних
досліджуваних матеріалів в організмі зародка та специфіку ушкоджуючої дії
кожного з них. Одержані дані можуть бути в подальшому задіяні в розробці
концепції з оцінки безпечності вуглецевих матеріалів різної дисперсності.
1. Технічне вугілля (сажа), алмазні наночасточки та терморозширений
графіт негативно впливали на перебіг ембріогенезу: підвищувався рівень
смертності (з 8,7 % в контрольній групі до 85 % у групі із введеним
терморозширеним графітом), при цьому близькі між собою значення даного
показника спостерігалися для експериментальних груп із введенням сажі і
алмазних наночасточок (33,3 % та 32,4 % відповідно); порушувався кровообіг у
стінці жовткового мішка (достовірно вищий відносно контрольної групи рівень
запустіння судин у цих експериментальних групах); зменшувалися розміри тіла
зародків (33,3 %, 41,2 % та 90 % маленьких зародків у групах із технічним
вугіллям, алмазними наночасточками і терморозширеним графітом відповідно
при 13% у контрольній групі).
2. Результати проведених світлооптичних та ультраструктурних досліджень
курячих ембріонів протягом всього періоду ембріогенезу на тканинному і
клітинному рівнях не виявили патологічного впливу активованого вугілля на
зародки.
3. Світлооптичні та ультраструктурні дослідження свідчили про негативний
вплив технічного вугілля, в першу чергу, на кровоносну систему зародка:
ушкодження стінки судин, агрегація еритроцитів, порушення мікроциркуляції
органів.
138
4. Електронно-мікроскопічні дослідження показали здатність алмазних
наночасточок до проникнення в клітини, що супроводжувалось враженням
мітохондрій і порушенням їх структури.
5. Світлооптичні та ультраструктурні дослідження встановили потужну
ушкоджуючи дію терморозширеного графіту щодо провізорних органів та тіла
зародка. Наявність пікнозу і рексису ядер, мутна цитоплазма, нечіткі межі та
деформація клітин оболонок та тіла ембріона вже на ранніх етапах ембріогенезу
вказували на некротичні зміни, спричинені введенням цього матеріалу, на
пізніших стадіях тканини перетворювались на клітинний детрит. Введення цього
матеріалу призвело до несумісних з подальшим розвитком наслідків: ушкодження
судин стінки жовткового мішка, прилеглих тканин зародка, механічного
руйнування оболонок та органел клітин, що напряму контактували з часточками
та агрегатами цього матеріалу.
6. Активоване вугілля, технічне вугілля та алмазні наночасточки були здатні
до міграції організмом з током крові. Гостре ураження кровоносної системи
зародків при введенні їм терморозширеного графіту не дало можливості оцінити
цей шлях поширення. Встановлено найнижчу серед інших вуглецевих часточок
проникну здатність технічного вугілля та найвищу – для алмазних наночасточок.
Виразні порушення плазматичної мембрани та клітинних органел включно з
двомембранними – мітохондрій та ядер під впливом алмазних наночасточок
опосередковано підтверджувало їх присутність в клітинах не тільки зародкових
оболонок, а й самого ембріона.
7. Виявлені патологічні зміни в тканинах курячих ембріонів, які зазнали дії
технічного вугілля, алмазних наночасточок та терморозширеного графіту,
засвідчують можливість їхнього тератогенного впливу на живі організми.