Использование полимеразной и лигазной цепных реакций в реальном времени для высокочувствительной диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом Романенкова, Майя Леонидовна

brief description

Романенкова,МайяЛеонидовна.Использованиеполимеразнойилигазнойцепныхреакцийвреальномвременидлявысокочувствительнойдиагностикигеморрагическойлихорадкиспочечнымсиндромом: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Уфа, 2006. - 112 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
61:06-3/1273 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР Институт биохимии и генетики На правах рукописиРоманенковаМайяЛеонидовнаИСПОЛЬЗОВАНИЕПОЛИМЕРАЗНОЙИ ЛИГАЗНОИЦЕПНЫХРЕАКЦИЙВРЕАЛЬНОМВРЕМЕНИДЛЯВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙДИАГНОСТИКИГЕМОРРАГИЧЕСКОЙЛИХОРАДКИСПОЧЕЧНЫМСИНДРОМОМДиссертация

стр. 53
(AMV-ревертаза и dNTP от фирмы "Promega", США). 2.6.ПолимеразнаяцепнаяреакциявреальномвремениАмплификацию вирусной кДНК проводили с помощью методаполимеразнойцепнойреакциивреальномвремени(ПЦР-РВ). К 29 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ трис-НС1 (рН=8,8), 2,5 мМ MgCb, 0,01% твин-20, 200 мкМ

стр. 88
непосредственно на РПК-матрице. 89 Разработанные методики могут быть использованы в дальнейшемдлядиагностических целей и позволят проводитьвысокочувствительнуюдетекцию хантавирусной РНК за максимально короткоевремяна ранних стадиях ГЛПС. ВЫВОДЫ: 1. Разработанывысокочувствительныеметоды детекции продуктовполимеразнойилигазнойцепныхреакцийв режимереальноговремени, использующие эффект резонансного переноса энергии...

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Романенкова, Майя Леонидовна
Список сокращений.
Введение.
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом.
1.2. Молекулярная биология, филогения и разнообразие хантавирусов.
1.2Л. Соответствие различных серотипов хантавирусов определенным хозяевам-переносчикам.
1.2.2. Особенности организации генома хантавирусов.
1.2.3. Синтез вирусной РЖ и созревание вирионов.
1.3. Диагностика ГЛПС.
1.3.1. Метод флюоресцентных антител.
1.3.2. Иммуно-пероксидазное окрашивание.
1.3.3. Иммуноферментный анализ.
1.3.4. Иммунохроматографические тесты.
1.3.5. Полимеразная цепная реакция. 1.3.5.1. ОТ-ПЦР, «гнездовая» ОТ-ПЦР.
1.3.5.2. ПЦР в реальном времени.
1.3.5.3. ЛЦР в реальном времени.
Глава 2. Объект и методы исследований.
2.1. Краткая характеристика объектов исследований.
2.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.3. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях. 2.4. Выделение и очистка РНК из аутопсийных тканей.
2.5. Синтез кДНК. 2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.
2.7. Фосфорилирование 5'-концов олигонуклеотидных праймеров.
2.8. Получение одинарных и двойного олигонуклеотидных дуплексов и определение их температуры плавления.
2.9. ЛЦР или ОТ-ЛЦР в режиме реального времени.
2.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.11. Реактивы и материалы.
2.12. Составы использованных стандартных растворов.
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.
3.1. Реакции с плазмидной ДНК.
3.1.1. Характеристика объекта исследований.
3.1.2. Проверка плазмиды pCRII на наличие вставки.
3.1.3. Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР и ЛЦР в реальном времени.
3.1.4. Проведение ПЦР и ЛЦР с оптимизированными параметрами реакций.
3.2. Проведение ОТ-ПЦР и ОТ-ЛЦР на синтетической матрице. 67 ^ 3.2.1. ПЦР с SYBR Green I и FAM/ROX.
3.2.2. ЛЦР с SYBR Green I и FAM/ROX.
3.3. ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ с препаратами, содержащими вирусную РНК.
3.3.1. Реакции с построением кДНК.
3.3.1.1. ОТ-ПЦР с ST-pol.
3.3.1.2. ОТ-ПЦР с M-MLV-revertase/Tth-pol.
3.3.2. Реакции на РНК-матрице. 3.3.2.1. ЛЦР на РНК (четыре праймера).