НІКОЛАЄНКО ТЕТЯНА ВАСИЛІВНА. АНГІОГЕННИЙ ПРОФІЛЬ КУЛЬТИВОВАНИХ ЕНДОТЕЛІОЦИТІВ В УМОВАХ МОДИФІКАЦІЇ МІКРООТОЧЕННЯ ПРО- ТА АНТИАНГІОГЕННИМИ ФАКТОРАМИ

brief description

НІКОЛАЄНКО ТЕТЯНА ВАСИЛІВНА. Назва дисертаційної роботи: "АНГІОГЕННИЙ ПРОФІЛЬ КУЛЬТИВОВАНИХ ЕНДОТЕЛІОЦИТІВ В УМОВАХ МОДИФІКАЦІЇ МІКРООТОЧЕННЯ ПРО- ТА АНТИАНГІОГЕННИМИ ФАКТОРАМИ"

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
НІКОЛАЄНКО ТЕТЯНА ВАСИЛІВНА
УДК: 616.82-005.4:612
АНГІОГЕННИЙ ПРОФІЛЬ КУЛЬТИВОВАНИХ ЕНДОТЕЛІОЦИТІВ В
УМОВАХ МОДИФІКАЦІЇ МІКРООТОЧЕННЯ ПРО- ТА
АНТИАНГІОГЕННИМИ ФАКТОРАМИ
03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія
Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Науковий керівник
Гарманчук Людмила Василівна,
Доктор біологічних наук, професор
Київ – 2016
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ ………………………………………. 5
ВСТУП ………………………………………………………………………... 6
РОЗДІЛ 1………………………………………………………………………. 12
1.1Загальна характеристика VEGF як ключового фактора ангіогенезу…. 12
1.2 Шляхи регуляції ангіогенезу…………………………………………….. 15
1.3 Ангіогенез: норма та патологія…………………………………………... 21
1.4Моделювання ангіогенезу в системі in vitro………………………………... 24
1.5 Метаболізм ендотеліальних клітин в нормі та за патологічних
станів……………………………………………………………………………. 27
1.6 Терапія спрямована на ангіогенез ……………………………………….. 30
РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ…………………….. 34
2.1 Матеріали та обладнання………………………………………………….. 34
2.2 Об’єкти досліджень………………………………………………………... 35
2.2.1 Клітинні лінії…………………………………………………………….. 35
2.2.2. Тест-агенти………………………………………………………………. 35
2. 3 Модель перещеплюваної карциноми легень Льюїс…………………….. 36
2. 4 Отримання первинної культури карциноми легені Льюїс…………….. 37
2.5Отримання перитонеальних макрофагів………………………………….. 37
2.6 Отримання та очищення VEGF …………………………………………... 38
2.7 ДСН–ПААГ електрофорез за Лемлі……………………………………… 39
2.8 Дот-блот аналіз…………………………………………………………….. 39
2.9 Вестерн-блот аналіз………………………………………………………... 39
2.10 Оцінка виживання клітин в камері Горяєва……………………………. 40
2.11 Оцінка виживання клітин з використанням МТТ-тесту……………….. 40
2.12 Визначення кількості апоптичних клітин та розподілу за фазами
клітинного циклу цитофлуориметричним методом ………………………... 41
2.13 Визначення рівня секреції VEGF клітинами…………………………… 42
3
2.14 Вимірювання рівня NO2
-
в культуральному середовищі
за допомогою реакції Грісса…………………………………………………... 43
2.15 Визначення глюкози глюкозооксидазним методом…………………… 44
2.16 Статистичний аналіз……………………………………………………... 44
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ……………………. 45
РОЗДІЛ 3 ХАРАКТЕРИСТИКА МОДЕЛЬНИХ СИСТЕМ
КУЛЬТИВОВАНИХ ЕНДОТЕЛІОЦИТІВ ДЛЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
ОСОБЛИВОСТЕЙ ЇХ ФУНКЦІОНУВАННЯ ЗА ДЕФІЦИТУ
ТРОФІЧНИХ СУБСТРАТІВ ТА ВПЛИВУ VEGF ТА АНТИ-VEGF……. 45
3.1 Моделі культивованих ендотеліоцитів………………………………….. 46
3.2 Модель логарифмічного та стаціонарного росту……………………….. 47
3.3 Модель довготривалого культивування без заміни середовища
(unfed culture)…………………………………………………………………………… 55
3.4 Модель культури клітин синхронізованої в фазі клітинного циклу
G0/G1…………………………………………………………………………… 58
РОЗДІЛ 4 ОСОБЛИВОСТІ СЕКРЕЦІЇ ОКСИДУ АЗОТУ ТА
УТИЛІЗАЦІЇ ГЛЮКОЗИ ЕНДОТЕЛІАЛЬНИМИ КЛІТИНАМИ В
РІЗНИХ УМОВАХ КУЛЬТИВУВАННЯ…………………………………….. 61
4.1 Утилізація глюкози та продукція NO ендотеліальними клітинами за
логарифмічного та стаціонарного росту…………………………………….. 62
4.2 Вплив VEGF та анти-VEGF на метаболізм глюкози та активність NOсинтази за умов unfed culture………………………………………………………... 65
4.3 Ідентифікація активності іNOS…………………………………………… 69
РОЗДІЛ 5 ПАРАКРИННИЙ ТА АУТОКРИННИЙ ВПЛИВ VEGF НА
ЕНДОТЕЛІАЛЬНІ КЛІТИНИ………………………………………………… 72
5.1 Вплив пухлинних клітин на ендотеліоцити……………………………… 72
5.2Вивчення ангіогенного потенціалу макрофагів…………………………. 74
5.3 Аутокринна продукція VEGF ендотеліальними клітинами за різних
умов культивування…………………………………………………………… 77
4
РОЗДІЛ 6 ВПЛИВ ПОТЕНЦІЙНИХ ЗАСОБІВ З ТЕРАПЕВТИЧНИМ
ЕФЕКТОМ ЩОДО АНГІОГЕНЕЗ-АСОЦІЙОВАНИХ ПАТОЛОГІЧНИХ
СТАНІВ……………………………………………………………………….. 79
6.1 Вплив на ендотеліальні клітини сполук потенційних інгібіторів HIF-1. 79
6.2 Вплив мітокоректину на ендотеліальні клітини………………………… 90
6.3 Вплив калікс[4]арену С-145 на ангіогенний профіль ендотеліоцитів…. 95
6.4 Ефект пептидоміметиків по відношенню до ендотеліальних клітин….. 98
РОЗДІЛ 7 УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ…………. 102
ВИСНОВКИ……………………………………………………………………. 111
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ…………………………………….. 113
5
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
ЕДТА – етилендіамінтетраоцтова кислота
ЕТС – ембріональна теляча сироватка
М2 – мітокоректин
МТТ – 3-(4,5-диметилтіазолін-2)-2,5-іл дифенілтетразолій бромід
КПС – капіляроподібні структури
GLUT – білки-транспортери глюкози
HIF-1 – гіпоксія індуцибельний фактор-1
сNOS – конститутивна синтаза оксиду азоту
eNOS – ендотеліальна синтаза оксиду азоту
іNOS – індуцибельна синтаза оксиду азоту
LLC – лінія клітин перещеплюваної карциноми легень Льюїс
МАЕС – лінія ендотеліальних клітин, отримана із аорти миші
РАЕ – лінія ендотеліальних клітин, отримана із аорти свині
VEGF – фактор росту ендотеліальних клітин
VEGF-R1 – рецептор фактору росту ендотеліальних клітин типу 1
VEGF-R2 – рецептор фактору росту ендотеліальних клітин типу 2
6
ВСТУП
Актуальність теми. Відомо, що ендотелій – це одношаровий пласт
спеціалізованих клітин, який вистилає внутрішній шар кровоносних, лімфатичних
судин та камер серця. За фізіологічного та патологічного ангіогенезу залучено
низку біологічно активних молекул, які регулюють метаболізм та функціонування
ендотеліальних клітин. В нормі баланс проангіогенних та антиангіогенних
факторів обумовлює детермінованість ангіогенезу [1-3], тоді як дисбаланс
ангіогенних факторів є причиною ряду захворювань, в тому числі ішемії та є
фактором прогресії злоякісних новоутворень. За патологічних станів
функціональний та метаболічний статус ендотеліоцитів формує їх ангіогенний
профіль, який пов’язують з активацією проліферативних процесів, здатністю
клітин мігрувати в гіпоксичні зони та переключенням їх метаболічного фенотипу,
що призводить до зростання утилізації глюкози ендотеліальними клітинами,
формування в мікрооточенні дефіциту трофічних субстратів, факторів росту та
накопичення лактату. Іншою особливістю функціонування ендотеліальних клітин
за патологічних умов є дисфункція в активності ендотеліальної Ca2+-
- залежної та
індуцибельної Ca2+-
- незалежної NO-синтази. Гіперекспресія проангіогенних
факторів (зокрема VEGF) є ключовою властивістю злоякісного росту та
чинником прогресії пухлини з формуванням метастазів [4, 5]. В неоангіогенезі
VEGF виступає селективним мітогенним фактором ендотеліальних клітин [6, 7],
до експресії якого залучені не лише пухлинні клітини, а й власне ендотеліоцити, а
також фагоцитуючі клітини, пухлино-асоційовані лімфоцити і т.д. Потужним
регулятором проангіогенного переключення вказаних клітин є гіпоксія
індуцибельний фактор (HIF-1) [8], який активує транскрипцію проангіогенних
генів, залучених до реактивності судин, біохімічних процесів, що включають
енергетичний метаболізм в анаеробних умовах, активацію eNOS та iNOS,
мобілізацію та міграцію із кісткового мозку мезенхімальних стовбурових клітинпопередників ендотеліоцитів [9]. Таким чином, ангіогенний профіль
7
ендотеліоцитів складають проліферативні, морфологічні, апоптичні показники, а
також метаболічні, зокрема такі як утилізація глюкози та активність NO-синтази,
опосередковано внутрішньоклітинним та міжклітинним месенджером - оксидом
азоту (NO) [10]. Тому вивчення процесів порушення функціонування
ендотеліоцитів за патологічних станів та вплив мікрооточення розширять
уявлення про перспективи про- та антиангіогенної терапії [11]. Отже, особливості
функціонування ендотеліоцитів в різних модельних системах та взаємовплив
різних типів клітин, що залучені до процесу ангіогенезу, є перспективним
напрямом для фундаментальних наукових, а також передклінічних досліджень.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційну роботу виконано на кафедрії біохімії ННЦ «Інститут біології»
Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках
бюджетної теми «Механізми реалізації адаптаційно – компенсаторних реакцій
організму за умови розвитку різних патологій» ( № д/р 0111U004648), а також
бюджетної теми «Розробка нанобіотехнологічних підходів отримання квантових
точок сульфіду кадмію та дослідження їх біологічної активності» Відділення
цільової підготовки Київського національного університету імені Тараса
Шевченка при НАН України (д/р 0114U003873); бюджетної теми «Аналіз впливу
складових молекули калікс[4]арену С-145 на ендотеліоцити у іморталізованій
культурі клітин» (№ д/р 0116U007376С), бюджетної теми «Синтез
флуоресцентних, флуоровмісних, фоточутливих та конформаційно утруднених
амінокислот та налагодження біологічних тестів (№ д/р0114U003471)
Мета та завдання дослідження Мета дослідження полягала у визначенні
ангіогенного профілю культивованих ендотеліоцитів за функціональними та
метаболічними показниками в умовах модифікації їх мікрооточення,
обумовленого нестачею трофічних субстратів, частковою гіпоксією, селективним і
опосередкованим впливом про- і антиангіогенних факторів та потенційних
терапевтичних засобів.
8
Досягнення мети передбачало вирішення наступних завдань:
1) Відтворити модель культивованих ендотеліальних клітин в умовах
часткової гіпоксії та дефіциту індукторів проліферації та трофічних субстратів.
2) Оцінити вплив прямих індукторів та інгібіторів ангіогенезу (VEGF та
анти-VEGF) на рівень утилізації глюкози та продукції оксиду азоту за стандартних
та збіднених за субстратами і киснем умовах культивування
3) Визначити біологічні ефекти VEGF та VEGF-збагаченого середовища
культивування перитонеальних макрофагів мишей з карциномою легені Льюїс на
ендотеліальні клітини за довготривалого культивування без заміни середовища
інкубації.
4) Оцінити модифікуючий вплив на ангіогенний профіль ендотеліальних
клітин потенційних проангіогенних факторів: нейронального антиішемічного
засобу мітокоректину та потенційного антитромботичного - калікс[4]арену С-145.
5) Визначити опосередковану дію інгібіторів HIF-1 та фотоформ
пептидоміметика на особливості функціонування культивованих ендотеліоцитів.
Об’єкт дослідження – культивовані ендотеліальні клітини, макрофаги,
перещеплювана модель карциноми легені Льюїс.
Предмет дослідження – проліферативні, біохімічні, морфологічні показники
ендотеліальних клітин за різних умов культивування та впливу клітинпродуцентів VEGF і сполук з ангіогенез-асоційованим механізмом дії.
Методи дослідження: методи культури клітин, цитоморфологічні,
цитофлюориметричні, колориметричні, імуноферментні, біохімічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Охарактеризовано ряд
модельних систем культивованих ендотеліальних клітин для дослідження
механізмів ангіогенезу in vitro за такими характеристиками, як проліферативна
активність ендотеліальних клітин, апоптичні показники, активність NO-синтази та
ступінь утилізації глюкози за умов модифікації середовища інкубації нестачею
трофічних субстратів довготривалим, безсиворотковим та частково безкисневим
культивуванням. Отримано дані, що підтверджують залучення пухлинних клітин
та макрофагів у процес ангіогенезу, а також продемонстровано, що ендотеліальні
9
клітини за безсивороткових умов культивування є активними продуцентами
VEGF, який слугує фактором виживаності клітин. Доповнено наукові дані щодо
впливу антиішемічного засобу мітокоректину на утилізацію глюкози та
активність ендотеліальної NO-синтази, що є свідченням його проангіогенної дії та
доведено стимулюючий ефект антитромбоцитарного засобу калікс[4]арену С-145
на лінії ендотеліальних клітин. Продемонстровано різнонаправлену дію син- і
анти-ізомерів 2-(2-амінотіазол-4-іл)-2-гідроксиімінооцтових кислот - аналогів
інгібіторів HIF-1 на проліферативні та метаболічні показники ендотеліальних
клітин. Вперше встановлено, що закрита форма фоточутливого пептидоміметика
характеризується селективністю дії по відношенню до типу культивованих клітин
та менш вираженою цитотоксичністю по відношенню до ендотеліальних клітин.
Практичне значення одержаних результатів. Відтворені модельні системи
культивування ендотеліальних клітин за різних умов мікрооточення можуть бути
використані для скринінгу речовин з ангіогенез-асоційованим механізмом дії.
Отримані дані щодо проангіогенної дії калікс[4]арену С-145 та нового
трофінотропіну мітокоректину дозволяють їх рекомендувати у якості потенційних
лікарських засобів за ішемічних та гемостатичних дисфункцій. Отримані
результати щодо дії син- і анти-ізомерів 2-(2-амінотіазол-4-іл)-2-
гідроксиімінооцтових кислот на ендотеліоцити можуть бути основою для
подальшого їх використання для нормалізації гіпоксія-індукованих станів.
Доведена селективність дії різних фотоформ пептидоміметиків по відношенню до
пухлинних та ендотеліальних клітин є перспективним напрямком для оцінки
можливості використання їх у фотодинамічній терапії раку.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено пошук та
опрацювання фахової літератури з теми дослідження, аналіз сучасного стану
проблеми, проведення експерименту, обробка та теоретичне обґрунтування
результатів досліджень. Формування ідеї та мети роботи, постановка завдань,
моделювання експерименту, планування методичних підходів, узагальнення
результатів досліджень та редагування дисертаційної роботи здійснено спільно з
науковим керівником. Автор виносить подяку к.м.н., професору Лондонського
10
університету І.Т. Гуту за надання ліній ендотеліальних клітин миші та свині.
Автор вдячний проф., д.м.н. О.М. Макаренку за люб’язно наданий трофінотропін
мітокоректин (М2), к.х.н., ст.н.сп. С.І. Орисик з Інституту загальної та
неорганічної хімії ім. В.І. Вернадського НАНУ за надані новосинтезовані син- та
анти–ізомери-похідні 2-(2-амінотіазол-4-іл)-2-гідроксиімінооцтових кислот, к.б.н.
В.О. Чернишенку з Інституту біохімії імені О.В. Паладіна за надані калікс[4]арен
С-145 та його фрагмент, завідуючій НДЛ експериментальної онкології
Національного інституту раку к.б.н. Н.М. Храновській та ст.н.сп., к.б.н.
О.В. Скачковій за допомогу в дослідженні параметрів клітинного циклу та рівня
апоптозу, д.х.н. І.В. Комарову з «Інституту високих технологій» Київського
національного університету імені Тараса Шевченка за надані пептидоміметики.
Автор виносить подяку к.ф.н. Б.І. Лупині з НДІ «Прикладної електроніки» за
моніторинг та стандартизацію вмісту газів у вуглекислотному інкубаторі.
Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення
дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на Науково-практичній
конференція «Біологічно активні речовини: фундаментальні та прикладні питання
отримання і застосування» (Новий Світ, Крим, 2011), IX Міжнародній науковій
конференції для студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2013), I
Міжнародній науковій конференції “Тиждень клітинних технологій” (Kиїв, 2013),
XII Міжнародній науковій конференції для студентів та молодих вчених
«Шевченківська весна» (Київ, 2014), 24 European Stroke Conference (Vienna,
Austria, 2015), 40th FEBS Congress (Berlin, Germany, 2015), 4th European Congress
of Immunology (Vienna, Austria, 2015), 25 European Stroke Conference (Venice, Italy,
2016), The EFIS-EJI Ruggero Ceppellini advanced School of Immunology
“Metchnikoff’s legasy: tissue phagocytes and functions”(Naples, Italy, 2016), 8th EFISEJI South East European Immunology School (Durres, Albania, 2016).
Публікації. За результатами досліджень опубліковано 23 наукові праці, з
яких 8 наукових статей у фахових виданнях, що відповідають вимогам МОН
України, в тому числі 3 в журналах, що індексуються міжнародною
наукометричною базою даних Scopus, 2 статті у інших виданнях, а також 13
11
матеріалів і тез доповідей на всеукраїнських та міжнародних наукових
конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу,
огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, 4 розділів результатів власних
досліджень із обговоренням, аналізу та узагальнення результатів досліджень,
висновків, списку використаних джерел, який складається з 185 найменувань.
Матеріали дисертаційної роботи викладені на 131 сторінці (з яких основна
частина займає 120 сторінок), ілюстрована 39 рисунками та 7 таблицями.

bibliography

ВИСНОВКИ
В дисертаційній роботі на моделях культивованих ендотеліальних клітин
досліджено функціональні, метаболічні та структурні особливості
ендотеліоцитів за нестачі трофічних та ростових субстратів, довготривалого
культивування, часткової гіпоксії, пригнічення та активації селективними та
опосередкованими факторами з про- та антиангіогенною дією.
1. Проаналізовано параметри росту культивованих ендотеліальних
клітин за різними функціональними та біохімічними показниками і показано,
що VEGF проявляє виражений пропроліферативний, ангіогенний ефект по
відношенню до ендотеліальних клітин та виступає чинником їх виживаності в
умовах культивування unfed culture та часткової гіпоксії.
2. Виявлено, що за дії VEGF та анти-VEGF рівень утилізації глюкози
за стандартних та збіднених на субстрати і кисень умов культивування
залежить від терміну культивування:збільшується у віддалені терміни інкубації
(3-5 діб) за дії VEGF в умовах нестачі трофічних субстратів та пригнічується за
даних умов під впливом анти-VEGF.
3. Оксид азоту, як основний посередник активності NO-синтаз
(ендотеліальної за стандартних умов та індуцибельної за часткової гіпоксії)
асоційований з проліферативним фенотипом ендотеліоцитів за стандартних
умовах культивування та чинить проапоптичну дію за нестачі кисню та
поживних субстратів.
4. Зафіксовано, що VEGF-збагачене середовище культивування
перитонеальних макрофагів мишей з карциномою легені Льюїс стимулює
проліферацію ендотеліальних клітин на синхронізованій в G0/G1 культурі, з
найбільшою вираженністю на етапі активного метастазування та
васкуляризації, що проявлялось збільшенням клітин в фазі проліферативного
пулу (G2/M+S) майже в 10 разів (р<0,01) в порівнянні з культурою без впливу
та в 8 разів, порівняно із дією культури перитонеальних макрофагів, отриманих
від інтактних тварин.