Пептидергическая регуляция экспрессии сигнальных молекул при старении клеток коры головного мозга крыс Умнов, Роман Сергеевич

brief description

УМНОВ Роман Сергеевич. ПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ ПРИ СТАРЕНИИ КЛЕТОК КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.01.30 / УМНОВ Роман Сергеевич;[Место защиты: Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения РАМН].- Санкт-Петербург, 2014.- 111 с.
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИкандидат наук Умнов, Роман Сергеевич
Список сокращений..............................................................................................................................................................................................4
Введение..................................................................................................................................................................................................................................5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Молекулярные аспекты возрастной
патологии и пептидергической регуляции функций головного мозга..........................| ^
1.1. Молекулярные аспекты возрастной патологии головного мозга..................11
1.2. Пептидная регуляция функций головного мозга......................................................................23
1.2.1. Кортексин......................................................................................................................................................................................23
1.2.2. Пептид ЕБЯ..............................................................................................................................................................................27
1.3. Сигнальные молекулы - маркеры старения головного мозга..............................з 1
1.3.1. Серотонин......................................................................................................................................................................................32
1.3.2. Кальмодулин............................................................................................................................................................................33
1.3.3. Пролиферативный протеин Кл67..........................................................................................................34
1.3.4. Апоптотический протеин р53......................................................................................................................34
1.3.5. Виментин........................................................................................................................................................................................35
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................................................36
2.1. Характеристика исследуемого материала..............................................................................................36
2.2. Приготовление раствора пептидов для введения в культуру................................37
2.3. Методы клеточных культур............................................................................................................................................38
2.3.1. Органотипическое культивирование..............................................................................................39
2.3.2. Диссоциированное культивирование............................................................................................40
2.4. Иммуноцитохимическое исследование......................................................................................................43
2.5. Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений....................................................................................................................................................46
2.6. Метод молекулярного моделирования........................................................................................................46
2.6.1. Моделирование оптимальной конформации пептидов..................................46
2.6.2. Расчет индекса гидрофобности................................................................................................................50
2.6.3. Моделирование молекулы ДНК..............................................................................................................50
2.6.4. Докинг..................................................................................................................................................................................................50
2.7. Статистическая обработка результатов......................................................................................................53
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..............................54
3.1. Пептидергическая регуляция пролиферации, апоптоза и функциональной активности клеток коры головного мозга при их старении
в диссоциированной культуре............................................................................................................................................................^
3.1.1. Пептидергическая регуляция экспрессии апоптотического
белка р53..................................................................................................................................................................................................................................54
3.1.2. Пептидергическая регуляция экспрессии пролиферативного протеина Кл67..........................................................................................................................................................55
3.1.3. Пептидергическая регуляция экспрессии виментина....................
60
3.1.4. Пептидергическая регуляция экспрессии серотонина...................
62
3.1.5. Пептидергическая регуляция экспрессии кальмодулина..............
64
3.2. Пептидергическая регуляция пролиферации, апоптоза и функциональной активности клеток коры головного мозга в органотипической культуре молодых и старых крыс................................................................................^
3.2.1. Сравнительное влияние пептидных биорегуляторов в зависимости от их концентрации на экспрессию маркера пролиферации в культурах клеток........................................................................................................................................................................................................^
3.2.2.Пептидергическая регуляция экспрессии апоптотического белка Р53......................................................................................................................................................................................................................................................67
3.2.3. Пептидергическая регуляция экспрессии пролиферативного протеина Кл67..................................................................................................................................................................................................................67
3.2.4. Пептидергическая регуляция экспрессии кальмодулина............................68
3.2.5. Пептидергическая регуляция экспрессии серотонина......................................69
3.2.6. Пептидергическая регуляция экспрессии виментина........................................70
3.3. Конформационный анализ пептидов КЕБ и ЕБЯ..................................................................71
3.3.1. Конформационный анализ пептида ЕБЯ................................................................................71
3.3.2. Конформационный анализ пептида КЕБ................................................................................72
3.3.3. Сравнительный анализ конформаций пептидов КЕЭ и ЕБЯ..............73
3.3.4. Поиск сайта связывания для пептида ЕБЯ в молекуле ДНК................76
3.4. Моделирование молекулярных взаимодействий пептидов с дуплексом ДНК............................................................................................................................................................................................................79
3.4.1. Взаимодействие пептидов с последовательностью ё(ССТОСС).. 80
3.4.2. Взаимодействие пептидов с последовательностью с1(ССАОС).... 82
Заключение..........................................................................................................................................................................................................................85
Выводы......................................................................................................................................................................................................................................88
Практические рекомендации................................................................................................................................................................89
Указатель литературы......................................................................................................................................................................................90

bibliography

Сигнальные молекулы маркеры старения головного мозга
Экспрессия многих сигнальных молекул в головном мозге с возрастом изменяется. Снижается экспрессия киназ и фосфатаз, участвующих в фосфорилировании белка, происходят сдвиги кальциевого гомеостаза вплоть до формирования кальцификатов в мозговой ткани. Инволютивные процессы, связанные со старением затрагивают и клеточные системы осуществляющие укладку белковых цепей и их катаболизм, что приводит к снижению чувствительности гипоталамуса к регуляторным сигналам [Dorszewska J., 2013; Firlg M. et al. 2013].
Усиление с возрастом действия окислительного стресса (образования свободных радикалов) и накопление поврежденных окислением молекул (белков, нуклеиновых кислот и липидов) провоцирует множественную дисфункцию сигнальных путей [Gabuzda D., Yankner B.A., 2013]. Нейроны также испытывают дефицит энергии в результате митохондриальных нарушений, приводящих к изменению проницаемости мозговых сосудов. Это стимулирует образование в клетках карбонильных групп, ковалентной модификации цистеина, лизина и гистидина, перекисному окислению липидов, гликированию оснований ДНК и РНК. Образование при окислении липидов мембран двойных связей приводит к синтезу разнообразных липидных пероксидов и альдегидов [Hamilton L.K. et al. 2013; Mostany R. et al. 2013].
Возрастные проявления в центральной нервной системе (ЦНС) могут начать проявляться уже после 30 лет. Они характеризуются уменьшением количества нервных клеток, снижением мозгового кровотока, что приводит к уменьшению массы мозга и нарастанию величины свободного пространства между костями черепа и тканью мозга [Lipnicki D.M. et al. 2013]. Однако уменьшение количества нейронов не является определяющим фактором в обеспечении функций нервной системы. Важную роль играет сохранение функциональных связей между нейронами, которые осуществляются благодаря нейротрансмиттерам. К расстройствам памяти приводят сначала изменения сигнальных каскадов на уровне клеточного ядра, а затем уже нарушения структурно-функциональных свойств синаптических мембран и их деградация [Park J.H. et al. 2013; Samadani A.A., Moussavi Z., 2012].
Многочисленные исследования, проведенные за последние 10 лет, свидетельствуют о том, что даже во взрослом мозге происходят регенерационно-восстановительные процессы. Более того - существуют популяции нервных клеток-предшественников, принимающие в этих процессах непосредственное участие путем миграции в зоны повреждений и последующей дифференцировки в нейроны или глию [Raghavan A., Shah Z.A., 2012; Yin F., Jiang T., Cadenas E., 2013].
Основные популяции плюрипотентных нервных клеток-предшественников присутствуют во взрослом мозге в субвентрикулярной зоне и субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа. Эти клетки могут заменять поврежденные нейроны или астроциты, но не все из них претерпевают успешную дифференцировку, гибнут путем апоптоза [Buchman A.S. et al. 2013]. Многие нейротрофические факторы и цитокины могут стимулировать нейрогенез, рост нейритов и восстановление поврежденных синаптических связей. Повреждение аксонов и дендритов может компенсироваться их повторным отрастанием. Тем не менее, по сравнению с периферической нервной системой, в ЦНС присутствует множество ингибиторных сигналов, препятствующих успешной реиннервации клеток-мишеней в целях сохранения корректной структуры нервных связей.
Не только ЦНС, но и периферическая нервная система подвержена старению. В вегетативных ганглиях отмечается падение лабильности, в постганглионарных нервах - ослабление влияния на эффекторы, повышение чувствительности к гуморальным факторам и сдвиги в обмене медиаторов. Функции различных отделов нервной системы претерпевают существенные возрастные изменения; например, такие параметры, как вариабельность сердечного ритма и папиллярные осцилляции существенно снижаются с возрастом и при этом контролируются и симпатической, и парасимпатической системами. Изменения порогов чувствительности во взаимодействии двух этих систем приводит к сужению нормы реакции для многих рефлексов. Другие же рефлексы могут наоборот становиться гиперреактивными; например, спазматические явления в регуляции тонуса сосудов являются следствием преобладания вазоконстрикторного (-рецепторы) ответа над вазомоторным (-рецепторы) [Cai D., 2013; Habermann B., Hines D., Davis L., 2013]. Гиперактивность симпатической системы при старении вызывает также стойкое увеличение уровня норадреналина в крови, что может приводить к артериальной гипертензии, трудно поддающейся терапии.
С возрастом также происходит снижение содержания мелатонина, серотонина, норадреналина и дофамина в некоторых структурах мозга. Снижение уровня данных гормонов способствует нарушению памяти, замедлению скорости реакций, снижению переносимости обычных нагрузок. Уменьшение данных показателей на одну треть приводит к развитию сенильной деменции (старческого слабоумия) [Jellinger K.A., Attems J., 2012]. Данная патология встречается у 5—15 % лиц в возрасте старше 65 лет. Деменция представляет собой полиэтиологический синдром, причиной развития которого, как правило, становятся болезнь Альцгеймера, сосудистая деменция, смешанная деменция, алкогольная деменция, дисметаболическая энцефалопатия, травмы и опухоли головного мозга, нормотензивная гидроцефалия, болезнь Паркинсона, инфекционные заболевания ЦНС. В настоящее время деменция является широко используемым термином для обозначения состояний, характеризующихся выраженными нарушениями памяти и других когнитивных функций [Fidalgo S., Ivanov D.K., 2013; Hagemeier J., Geurts J.J., Zivadinov R., 2012].
Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений
Кортексин представляет собой комплекс полипептидов с молекулярной массой от 1000 до 10000 Да, выделенных из коры головного мозга телят или свиней и обладающий тканеспецифическим действием на кору головного мозга [Рыжак Г.А. и др., 2003]. В модели острой тяжелой черепно-мозговой травмы показано, что у крыс кортексин вызывал ускоренное восстановление функций головного мозга, которое проявлялось в значительном улучшении способности животных к обучению и воспроизведению условно-рефлекторного навыка, нормализации мышечного тонуса и координации движений. Введение кортексина после стресса вызывало у животных повышение в коре головного мозга серотонина. Активация серотонинергической системы, возникающей при введении крысам кортексина, свидетельствовала о церебропротекторной и антистрессорной активности кортексина, сопровождающейся нормализацией метаболизма в нейронах и восстановлением адаптивных возможностей головного мозга.
Кортексин способен подавлять токсическое действие препаратов таких фармакологических групп, как адреностимуляторы, нейролептики, холиномиметики и психостимуляторы. Кортексин обладает противоопухолевой активностью с преимущественным подавлением развития новообразований головного мозга. Препарат регулирует соотношение тормозных и возбуждающих аминокислот, уровень серотонина и дофамина, оказывает ГАМК-эргическое влияние, обладает антиоксидантной активностью и способностью восстанавливать биоэлектрическую активность головного мозга. Кортексин применяют при вирусных и бактериальных нейроинфекциях, астенических состояниях, энцефалопатиях различного генеза, острых и хронических энцефалитах и энцефаломиелитах, эпилепсии, нарушении памяти, мышления, сниженной способности к обучению, надсегментарных вегетативных расстройствах, различных формах детского церебрального паралича, задержке психомоторного и речевого развития у детей. Кортексин разрешен МЗ РФ к медицинскому применению приказом № 136 от 19.04.1999 (per. № 99.136.14). Эффективность кортексина при лечении дисциркуляторных энцефалопатии (ДЭ) исследована на 76 больных (52 мужчины и 24 женщины) в возрасте 36—48 лет с ДЭ I—II стадии [Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. 2003]. Длительность артериальной гипертензии была не менее 3 лет у 32 больных, закрытые травмы головного мозга в анамнезе — у 18. Диагноз ДЭ во всех случаях был подтвержден результатами неврологического и нейропсихологического исследования, данными компьютерной томографии, ультразвуковой допплерографии, электроэнцефало- и реоэнцефалографии, в том числе при проведении функциональных нагрузочных проб. В контрольной группе (31 человек) пациенты в амбулаторно-поликлинических условиях получали кавинтон, трентал, аспирин, тиклид, аминалон, ноотропил. В основную группу вошло 45 человек. Эти больные получали, кроме базисной терапии, кортексин, который вводили назальным электрофорезом по 10 мг ежедневно в течение 15 дней. Обе выборки были рандомизированы по полу, возрасту, стадии и генезу (гипертонический, атеросклеротический, посттравматический) заболевания. Об эффективности лечения пациентов обеих групп судили на основании обследований до лечения, во время лечения (10—11 день) и после лечения. Оценивали интеллектуально-мнестические функции, психоэмоциональный статус и функциональное состояние ЦНС по результатам данных психофизиологических тестов (ПСФ-тестов) и компьютерной электроэнцефалографии с количественной обработкой данных, а также селективного картирования мозга. Психофизиологическое обследование включало в себя тесты на интеллект («установление закономерностей, «аналогии», «корректурная проба», «кратковременная зрительная память», «оперативная память», «долговременная память»), психомоторные функции («реакция на движущийся объект», сенсомоторные реакции) и личностные особенности (цветовой тест Люшера, шкала тревожности Спилбергера). Общую эффективность определяли с помощью методики, основанной на алгоритме, позволяющем по формуле количественно оценивать тяжесть состояния больных и индекс их выздоровления в различные периоды лечения. У пациентов контрольной и, особенно, основной группы лечение сопровождалось улучшением следующих показателей: психоэмоциональное состояние (жалобы на повышенную утомляемость, рассеянность внимания, головные боли, снижение памяти, головокружение и др.); неврологический статус (выраженность и число рассеянных органических симптомов поражения ЦНС); интеллектуально-мнестические функции (концентрация и объем внимания, скорость переработки зрительной информации, точность восприятия, продуктивность пространственных представлений, объем и устойчивость кратковременной, долговременной и оперативной памяти, а также логическое мышление); функциональное состояние ЦНС, по данным тестов, определяющих нейрофизиологические показатели ЦНС, которые характеризуют возбудительный и тормозной процессы, уравновешенность и лабильность корковых процессов, а также уровень функциональных возможностей ЦНС; биоэлектрическая активность коры головного мозга, по данным электроэнцефалографии (спектральная плотность биоэлектрической активности коры головного мозга в диапазоне а- и р-ритмов, меж- и внутриполушарная когерентность, диапазон реакции на ритмическую фотостимуляцию, пластичность нейродинамических процессов, выраженность медленных компонентов электроэнцефалограммы (ЭЭГ) в диапазоне А- и (особенно) 9-ритма).
Улучшение психоэмоционального состояния при введении кортексина было достоверно выше, чем в контрольной группе. При этом положительный эффект кортексина наблюдался на 3—4-й день его введения и был достаточно стойким не только в течение всего периода лечения, но и через 3—5 нед. после окончания лечения, а в некоторых случаях и дольше (2—3 мес.). Наиболее выраженным было влияние кортексина на интеллектуально-мнестические функции. Больные отмечали улучшение объема и устойчивости памяти, объема и концентрации внимания и других интеллектуальных функций, что проявлялось не только на поведенческом уровне, но и по данным тестирования. Анализ количественных показателей эффективности реабилитации показал, что кортексин значительно повышает эффективность базисной терапии у больных с ДЭ. Применение назального электрофореза как способа введения кортексина обеспечивает выраженное и продолжительное нейрофизиологическое действие за счет создания в структурах мозга своеобразного депо препарата. Таким образом, полученные данные позволяют рекомендовать кортексин для улучшения психической деятельности, коррекции функционального состояния ЦНС и интеллектуально-мнестических функций при нарушении кровообращения головного мозга у лиц разных возрастных групп.