Воропаева, Елена Александровна. Роль микробиоценозов открытых полостей в формировании реактивности организма; диагностические критерии дисбиозов для оценки состояния здоровья человека

brief description

Воропаева, Елена Александровна. Роль микробиоценозов открытых полостей в формировании реактивности организма; диагностические критерии дисбиозов для оценки состояния здоровья человека : диссертация ... доктора биологических наук : 03.02.03 / Воропаева Елена Александровна; [Место защиты: ФГУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии"].- Москва, 2013.- 372 с.: ил.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ
«МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ
им. Г.Н. ГАБРИЧЕВСКОГО» РОСПОТРЕБНАДЗОРА
0520І351620
Воропаева Елена Александровна
РОЛЬ МИКРОБИОЦЕНОЗОВ ОТКРЫТЫХ ПОЛОСТЕЙ
В ФОРМИРОВАНИИ РЕАКТИВНОСТИ ОРГАНИЗМА;
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ДИСБИОЗОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ
СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА
03.02.03 - микробиология
14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология
Диссертация
на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор С.С. Афанасьев Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор В.А. Алёшкин
Москва 
Оглавление
Список сокращений 6
Введение 9
Глава 1. Обзор литературы 28
1.1. Микробиоценозы открытых полостей 28
1.1 Л.Общие положения 28
1.1 ^.Колонизационная резистентность 31
1.1.3. Биоплёнка 37
1.1.4. Показатели состояния микробиоценозов - показатели
реактивности макроорганизма 41
1.1.5. Микробиоценоз кожи 46
1.1 .б.Микробиоценоз ротоглотки 48
1.1.7. Микробиоценоз кишечника 51
1.1.8. Микробиоценоз влагалища и цервикального канала 65
1.1.9. Микробиоценоз уретры 81
1.2.3аболевания верхних дыхательных путей у детей 83
1.3. Патогенетические особенности микрофлоры при пародонтитах 86
1.4. Хламидиозы 87
1.4.1 .Урогенитальный хламидиоз 87
1.4.2. Патогенетическая роль Chi. pneumoniae 105
1.5.Этиологическая роль уреаплазм в возникновении и развитии воспалительных процессов гениталий 108
1.6. Роль микробиоценозов влагалища, кишечника и ротоглотки при
невынашивании беременности 117
1.7. Патогенетическая роль микроорганизмов при перитонитах 119
1.8. Роль врождённого иммунитета в инфекционной патологии 121
1.8.1 .Характеристика рецепторов врождённого иммунитета 121
1.8.2. Видовая специфичность TLR 126
1.8.3.Экспрессия TLR на клетках и в тканях человека 128
1.8.4. Активация TLR 132
з
1.8.5. Молекулярные механизмы взаимодействия TLR с клетками
макроорганизма 134
1.8.6. Роль TLR в патогенезе инфекционных заболеваний и инициации
местной антиинфекционной резистентности 139
Глава 2. Материалы и методы исследования 145
2.1. Клинико-лабораторная характеристика обследованных пациентов...145
2.1.1. Клинико-лабораторная характеристика детей с инфекционной патологией
респираторного тракта 145
2.1.2. Клинико-лабораторная характеристика больных пародонтозом 145
2.1.3. Клинико-лабораторная характеристика женщин с диагностированной
уреаплазменной инфекцией урогенитального тракта 146
2.1.4. Клинико-лабораторная характеристика женщин с диагностированным или перенесенным урогенитальным хламидиозом (УГХ) урогенитального
тракта 147
2.1.5. Клинико-лабораторная характеристика клинически здоровых женщин
контрольной группы 149
2.1 .б.Клинико-лабораторная характеристика беременных 150
2.1.7. Клинико-лабораторная характеристика пациентов с распространённым
гнойным перитонитом 150
2.1.8. Клинико-лабораторная характеристика низших приматов с установленной
спонтанной хламидийной инфекцией 151
2.2. Клинико-лабораторные методы исследования 151
2.2.1. Микроскопическое исследование мазков со слизистых УГТ 153
2.2.2,Оценка функционального потенциала мукозальной защиты 153
2.2.3. Микробиологические исследования 153
2.2.4. Молекулярно-генетические методы исследования 160
2.2.5. Цитологический метод диагностики хламидийной инфекции 164
2.2.6. Серологический метод диагностики хламидийной инфекции 165
2.2.7. Культуральный метод (диагностика хламидиоза) 165
2.2.8. Иммунологические методы исследования 165
2.2.9. Количественное определение содержания альбумина и общего белка в
слюне 167
2.2.10.Определение активности лизоцима в слюне 167
2.2.11. Гормональные исследования 167
2.2.12. Статистическая обработка полученных данных 167
Глава 3. Колонизационная резистентность слизистых открытых полостей как объективный показатель реактивности организма и интегральный показатель состояния их микробиоценозов 168
3.1. Состояние микробиоценоза ротоглотки при респираторной
патологии как индикатор инфекционной резистентности детей 168
3.2. Микробиоценоз ротоглотки при бронхитах у детей 173
3.3. Патогенетические особенности микробного пейзажа при
пародонтите 183
3.4. Микробиоценоз влагалища при уреаплазмозе 184
3.4.1 .Диагностическая значимость изменения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным и фунгицидным препаратам 199
3.5. Микробиоценоз влагалища и цервикального канала при
урогенитальной хламидийной инфекции 201
3.5.1. Колонизационная резистентность слизистых цервикального канала
как интегрирующая составляющая местного иммунитета 213
3.6. Микробиотопы влагалища и цервикального канала и их
патогенетическая роль при уреаплазмозе и хламидиозе 220
3.7. Состояние микробиоценозов влагалища, ротоглотки и кишечника
при невынашивании беременности 228
3.7.1. Микробиоценоз влагалища 228
3.7.2. Микробиоценоз ротоглотки 239
3.7.3 .Микробиоценоз кишечника 247
3.7.4.Особенности микроэкологии влагалища, полости рта и кишечника у беременных с инфекционным, гормональным и смешанным генезом невынашивания в ранние сроки гестации 255
3.7.5. Индивидуальный анализ состояния, взаимосвязи и взаимозависимости микробиоценозов влагалища, полости рта и кишечника у беременных 261
3.8. Микробиологическая характеристика распространенного гнойного
перитонита 262
3.8.1. Микробиологическая оценка эффективности бактериофаготерапии 269
3.8.2.Островки патогенности как дополнительный критерий оценки вирулентности штаммов микроорганизмов 274
Глава 4.Связь генотипических и фенотипических свойств возбудителя с клиническими проявлениями при хламидиозе обезьян 279
4.1. Взаимодействие факторов патогенности хламидий плазмиды и
гена IncA 282
4.2. Выявление чувствительности к антибиотикам 285
4.3. Роль генотипирования штаммов Ch. trachomatis в
прогнозировании их патогенности 286
Заключение 288
Алгоритм функционирования колонизационной резистентности слизистых открытых полостей 325
Выводы 326
Практические рекомендации 328
Список литературы 329
Список сокращений
Ат - антитела
БП - биологическая плёнка
БЭ - буккальный эпителий
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
Вл - влагалище
ВПГ - вирус простого герпеса
ВПЧ - вирус папилломы человека
ВУИ - внутриутробная инфекция
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
ЗСГ - задняя стенка глотки
ИЕКНЭ - естественная колонизация
назофарингеального эпителия
ИМ - инфекционный мононуклеоз
ИППП - инфекции, передаваемые половым путем
ИФА - иммуноферментный анализ
КИП - комплексный иммуноглобулиновый препарат
КК - культура клеток
КМ - культуральный метод
КОЕ - колониеобразующая единица
КР - колонизационная резистентность
КС - антитела - комплементсвязывающие антитела
ЛЦР - лигазная цепная реакция
Нг - носоглотка
ИГУ - негонококковый уретрит
НИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции
НЭ - назофарингеальный эпителий
ОП - островки патогенности
ОРВИ - острые респираторные вирусные инфекции
PAMP - консервативные молекулярные структуры
ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
ПИФ - прямая иммунофлуоресценция
ПР - промежуточное (переходное) тельце
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РИД - радиальная иммунодиффузия по Манчини
РИФ - реакция прямой иммунофлуоресценции
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации
РНК - рибонуклеиновая кислота
рРНК - рибосомальная РНК
PC - респираторно-синцитиальный вирус
ВЗОМТ - воспалительные заболевания органов малого таза
РТ - ретикулярные тельца
РСК - реакция связывания комплемента
УГИ - урогенитальная инфекция
УГТ - урогенитальный тракт
УГХ - урогенитальный хламидиоз
УЗИ - ультразвуковое исследование
УПМ - условно-патогенная микрофлора
Ур - уретра
ХИВЗ - хронические инфекционно- воспалительные заболевания
ЦС - цервикальный секрет
Цк - цервикальный канал
ЦМВ - цитомегаловирус
ЦОЕ - цветообразующая единица
ЧБД - часто болеющие дети
ЭТ - элементарные тельца
CD - клеточные рецепторы
DC - дендритные клетки
GM-CSF - гранулоцит макрофаг колониестимулирующий фактор
IFN - a - интерферон альфа IFN - у - интерферон гамма Ig - иммуноглобулин IgA - иммуноглобулин А IgG - иммуноглобулин G IgM - иммуноглобулин М IL - интерлейкин LPS - липополисахарид
МОМР - (major outer membrane protein) - основной белок наружной мембраны
NK - клетки - естественные киллеры
ORF - (open reading frame) - открытая рамка считывания
PRR - паттерн распознающие рецепторы
sc - свободный секреторный компонент
slgA - секреторный иммуноглобулин А
TLR (Toll-like receptor) - Toll-подобные рецепторы
TNF-a - фактор некроза опухолей альфа
Введение
Актуальность проблемы
Человек и окружающая среда - это единая экологическая система, находя¬щаяся в состоянии биологического равновесия между макро- и микроорганиз¬мами. Микрофлора человека является основой его микроэкологии и оказывает непосредственное влияние на жизнедеятельность и состояние макроорганизма. Микробиоценоз - своеобразная динамическая микроэкологическая система, способствующая созданию более или менее однородных условий для нормаль¬ной жизнедеятельности аутофлоры и выполняющая или регулирующая много¬численные функции макроорганизма. Показатели состояния микробиоценозов отражают состояние реактивности макроорганизма - способность организма от¬вечать на воздействия внешней среды изменением своей жизнедеятельности, что обеспечивает его адаптацию к различным условиям обитания. Кожа, респи-раторный, урогенитальный (УГТ) и желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), конъ-юнктива глаза, слизистая ротовой полости, постоянно подвергающиеся воздей¬ствию разнообразных чужеродных веществ и микроорганизмов, выполняют собственную барьерную функцию. Слизистые открытых полостей макроорга¬низма представляют собой единую систему. Барьерная функция этих областей определяется состоянием колонизационной резистености (КР) - способность микрофлоры и макроорганизма в кооперации защищать экосистему слизистых от патогенных микроорганизмов. КР можно рассматривать как интегрирующую составляющую местного иммунитета. Представители микрофлоры присут-ствуют в биотопах организма в виде фиксированных к определенным рецепто¬рам микроколоний, заключенных в биопленку, которая, как перчатка, покрыва¬ет кожу и слизистые открытых полостей и состоит, помимо микроорганизмов, из экзополисахаридов различного состава, а также муцина [36, 43, 98, 111,224].
Здоровье детей является главной характеристикой здоровья населения. В настоящее время сохраняется высокая распространенность болезней органов дыхания среди детей дошкольного и школьного возраста. Начало большинства бронхолегочных заболеваний связано с развитием патологических процессов в
слизистой оболочке верхних дыхательных путей и ротоглотке, которая в норме задерживает и элиминирует около 70% поступающего извне инертного и агрессивного антигенного материала. Инициация любого инфекционно¬воспалительного процесса начинается с прикрепления бактерий к поверхности восприимчивой ткани организма хозяина. Зависит от соотношения уровней индигенных микроорганизмов и условно-патогенной микрофлоры (УПМ), формирующих данный биотоп [89, 211, 214, 302].
При формировании патологического десневого кармана (пародонтального кармана) при пародонтите резко возрастает концентрация микроорганизмов в десневой жидкости. Десневая жидкость представляет собой транссудат, кото¬рый секретируется в области десневого желобка и практически сразу смешива¬ется с микрофлорой слизистой десны и ротовой жидкости. Концентрация бак¬терий у здорового человека в десневой жидкости составляет не более 100 тыс. клеток в мл, а при развитии гингивита или парадонтита составляет десятки и сотни миллионов. Количественные и качественные нарушения в составе сим¬бионтов, нарушения их взаимодействия с макроорганизмом имеют решающее значение в возникновении и развитии пародонтита. Вирулентность бактерий в значительной степени определяется их ферментативными свойствами, в част¬ности, протеазной активностью - фактор патогенности. Особое место занимают бактериальные IgAI-протеазы, расщепляющие секреторный и сывороточный IgAl (доминирующий подкласс IgA человека). Количественное содержание IgAI-протеазы в десневой жидкости может являться критерием развития воспа¬лительного процесса в пародонтальной области.
Масштабность распространения сексуально-трансмиссивных инфекций продолжает оставаться актуальной во всем мире. Инфекционно¬
воспалительные заболевания репродуктивной сферы, несмотря на достижения современной медицины, лидируют в структуре гинекологической
заболеваемости и остаются традиционно значимыми на протяжении последних лет. Урогенитальный хламидиоз (УГХ) и уреаплазмоз занимают ведущее место в структуре инфекций передаваемых половым путем. Возбудители хламидиоза
и уреаплазмоза - облигатные внутриклеточные паразиты - не относятся к патогенам, представляющим особую опасность, но на фоне растущей урбанизации, ухудшения социально-демографической и экологической ситуации инфицирование ими способно приводить к формированию различных осложнений, оказывающих неблагоприятное влияние как на общее состояние здоровья, так и на репродуктивную функцию населения [18, 54, 69, 89, 317].
Клинические варианты течения хламидийной и уреаплазменной инфекций в наибольшей степени определяются выраженностью изменений, вызываемых возбудителем в месте своей локализации. Слизистые содержат элементы биотопа (эпителиальные клетки, лейкоциты), являющиеся элементами конституциональной рецепторной системы организма, и в комплексе с другими гуморальными и клеточными факторами мукозального иммунитета определяют эффективность КР слизистых макроорганизма [9, 98, 234, 276, 394].
Среди группы возбудителей хламидийных инфекций человека, известных под общим названием «хламидиозы», особое значение для медицины представляют хламидии двух родов Chlamydia и Chlamydophila, носящие антропонозный характер: вид Chlamydia trachomatis, вызывающий различные уро-генитальные заболевания (уретрит, цервицит, эндометрит, простатит, орхит и др.), патологию беременности и родов, некоторые формы артрита, трахому, лимфогранулему венерум, патологию органов дыхания, офтальмию новорожденных, и вид Chlamydophila pneumoniae (биовар TWAR), являющийся респираторным возбудителем, а также играющий роль в патологии сердечнососудистой системы и головного мозга [54, 89, 227, 284, 318, 338].
Ureaplasma urealyticum - один из ведущих этиологических агентов воспалительных заболеваний женской половой сферы, приводящих к выраженным нарушениям репродуктивной функции, цервицитам, эндометритам, сальпингоофоритам, хореоамнеонитам, неонатальным инфекциям и др. Уреаплазмы распространены среди клинически здоровых
женщин. Пусковым моментом уреаплазменной инфекции является колонизация возбудителем эпителиоцитов хозяина [69, 89, 231].
Патогенетический потенциал патогенных бактерий и вирусов, хламидий и уреаплазм определяется их концентрацией в организме, наличием или отсут¬ствием у них определённых генов патогенности, состоянием микробиоценоза биотопа (лимитирующим фактором выступает присутствие УПМ и комменса¬лов, способных усилить патогенетический потенциал инфекционных агентов), изменением физиологического и иммунного статуса, соматическими заболеваниями и другими факторами. Большой интерес вызывает детальное изучение жизненного цикла штаммов хламидий и уреаплазм, их фенотипических признаков, особенностей структуры генома штаммов хламидий и уреаплазм, а также взаимодействие штаммов возбудителей между собой, штаммов хламидий со штаммами уреаплазм, штаммов хламидий и уреаплазм с УПМ и нормофлорой слизистых. При этом представляет интерес изучение видового состава, антибиотико- и фагорезистентности УПМ урогенитальных путей женщин и мужчин [6, 183, 253, 260, 278, 330, 346].
В физиологическом течении беременности определяющую роль отводят нормальному микробиоценозу различных биотопов организма, обеспечиваю¬щих формирование колонизационной резистентности слизистых. Изменения микробиоценоза, характерного для нормально протекающей гестации, рассмат¬риваются в качестве одной из причин осложнений беременности. Нарушения нормального микробиоценоза различных биотопов могут происходить под вли¬янием различных экзогенных и эндогенных факторов (стресс, применение ле¬карственных препаратов, гормональные нарушения, хронические экстрагени- тальные заболевания, иммуносупрессия и др.), что обусловливает развитие дисбиозов, характеризующихся нарушением соотношения микроорганизмов, повышением содержания УПМ в определенном биотопе и изменением микро- экологического гомеостаза в целом. Тем не менее в литературе нет единого мнения о частоте и характере различных форм дисбиотических изменений от¬крытых полостей организма при невынашивании беременности. Принципиаль-
но новым в изучении микробиоценозов является одновременная оценка микро¬экологии как просветной, так и пристеночной областей ротоглотки, кишечника и влагалища (Вл) с учетом Ig слизистых [37 83, 111, 204, 219, 222].
Перитонит, его классификация, оценка тяжести, лечение - одни из самых насущных вопросов современной хирургии [60]. В подавляющем большинстве случаев перитонит является полимикробным заболеванием [60, 143]. При пер¬вичном перитоните если источником перитонита является толстая кишка, то, более чем в 90% случаев определяется аэробно-анаэробная ассоциация микро¬организмов; если источником инфицирования является желудок или тонкая кишка, то такая ассоциация встречается значительно реже. Степень обсеменен- ности брюшной полости четко коррелирует с длительностью перитонита [48, 60]. Исходный спектр микрофлоры перитонеального экссудата при вторичном перитоните, характеризуется стабильным единообразием и преобладанием вы-соковирулентных грамотрицательных микроорганизмов [3]. Нерациональное применение антибактериальных препаратов приводит к существенному изме¬нению видового состава возбудителей перитонита [47, 197]. При отсутствии положительной динамики в течение перитонита на протяжении 3-4 суток в ходе программируемых хирургических санаций брюшной полости практически у всех пациентов отмечается увеличение удельного веса госпитальной микро¬флоры [49, 76], крайне высоко устойчивой к антибиотикам резерва [163]. Каж¬дый конкретный стационар характеризуется своим микробным пейзажем, одна¬ко, в последнее десятилетие многие авторы указывают на преобладание не¬ферментирующих микроорганизмов среди госпитальных штаммов (ацинето- бактер и псевдомонады). За ними следуют клебсиеллы, эшерихии, энтерококки и бактероиды [170, 246]. Практически все нозокомиальные штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника человека. При оценке значимости выделения УПМ у конкретных пациентов необходимо принимать во внимание такие факторы, как источник выделения, выделение в чистой культуре или в ас¬социации с другими микроорганизмами, а также степень обсемененности кли¬нического материала [3, 60, 149].
Известно, что система антиинфекционной резистентности организма оп¬ределяется качественным и количественным составом биопленки, формируемой индигенной микрофлорой, а также патогенными микроорганиз¬мами на эпителиальных поверхностях, местной и организменной антиинфекци¬онной резистеностью хозяина. Ключевым звеном в распознании макроорганизмом патогенов являются TL-рецепторы (TLR), составляющие основу мембранных комплексов и экспрессирующихся на всех клеточных элементах, участвующих в формировании резистентности (включая КР макроорганизма), в том числе и на поверхности слизистых [264, 288, 329, 476].
TLR способны распознавать консервативные молекулярные структуры, распространенные среди определенного класса микроорганизмов и отсутствующие у человека. Антиинфекционная защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции после взаимодействия патогенов с TLR, что сопровождается активацией генов цитокинового каскада, ответственного за активацию фагоцитов и других иммунокомпетентных клеток, Ig, что, в свою очередь, определяет уровень мукозальной КР и, в дальнейшем, блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление инфекционного агента из организма [264, 288, 321, 392, 485].
Детальное изучение жизненного цикла, фенотипических признаков, особенностей структуры генома возбудителей, влияния последних как монопатогенов, так и в ассоциации с УПМ, на формирование нарушений в ан-тиинфекционной резистентности на организменном и местном уровнях необходимо для установления новых патофизиологических и
иммунологических патогенетических механизмов развития этих инфекций. Тем самым, сократится колоссальный разрыв между фундаментальными
исследованиями биологии и морфологии хламидий и уреаплазм и клиническими исследованиями заболеваний, которые они вызывают, в ряде случаев позволит объяснить отсутствие симптоматики, возможность атипичных проявлений, бессимптомного течения инфекции. Кроме того, это открывает
новые возможности совершенствования и повышения информативности методов диагностики, лечения и профилактики, а также создания фармпрепаратов, воздействующих губительно на все формы цикла развития возбудителей, и новых иммуномодулирующих препаратов, вакцин с целью наиболее эффективного лечения и профилактики этих заболеваний.
Цель исследования:
Установление роли микробиоценозов респираторного, урогенитального и желудочно-кишечного трактов в формировании реактивности и антиинфекционной резистентности организма и оценка влияния дисбиотических нарушений на выраженность клинических проявлений инфекционно-воспалительных процессов при различных нозологических формах заболеваний.
Задачи исследования
1. Определить особенности формирования микробиоценоза слизистых дыхательных путей и факторов местного иммунитета у клинически здоровых детей и при респираторной патологии: острых респираторных вирусных инфекциях, тонзиллитах, ангинах, бронхитах, пневмониях.
2. Оценить качественный и количественный состав микрофлоры просвет¬ной и пристеночной областей и показатели местного иммунитета биотопа урогенитального тракта у клинически здоровых женщин репродуктивного возраста, больных уреаплазменной и хламидийной инфекциями. Выявить влияние инфицированности хламидиями и уреаплазмами на восприимчивость макроорганизма к гетерологичным возбудителям инфекций.
3. Оценить антибиотикорезистентность как фактор патогенности внутри¬клеточных возбудителей патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при уреаплазмозе, хламидиозе и распространённом гнойном перитоните в динамике при наблюдении пациентов.
4. Отработать подходы к оценке видовой и штаммовой вирулентности
возбудителей уреаплазмоза, хламидиоза и гнойного перитонита по выявлению у них генетических детерминант патогенности и антибиотикорезистентности. Обосновать целесообразность применения комплексных фаговых препаратов при санации брюшной полости при перитонитах
5. Изучить состояние пристеночного и просветного микробиоценоза слизистых влагалища, ротоглотки, кишечника и факторов местного иммунитета как критериев состояния здоровья у клинически здоровых беременных и женщин при невынашивании беременности. Проанализировать взаимосвязь выраженности нарушений указанных микробиоценозов при данной патологии.
6. На основании проведенных комплексных исследований выявить пато¬генетический, диагностический и прогностический потенциалы микробиоценозов биотопов открытых полостей и их взаимосвязь с показателями местного иммунитета.
7. Разработать алгоритм оценки функционального состояния колони-зационной резистентности слизистых респираторного, урогенитального и желудочно-кишечного тракта при инфекционно-воспалительных процессах различной локализации.
Научная новизна работы
Проведённые исследования позволяют представить микробиоценозы от¬крытых полостей макроорганизма как динамические микроэкологические си¬стемы, формируемые микрофлорой (совокупностью типичных для определен¬ного биологического вида и конкретного биотопа ассоциаций микроорганиз¬мов), иммунологическими факторами антиинфекционной защиты макроорга¬низма и воздействием окружающей среды. Биотопы открытых полостей харак¬теризуются единством и способностью к саморегуляции, являются интеграль¬ной частью организма хозяина и местного иммунитета, в частности. Колониза¬ционная резистеность является показателем состояния микробиоценоза биотопа и местной антиинфекционной резистености.
При респираторных заболеваниях у детей родовой и видовой состав микроорганизмов, выделенных от больных, может служить дополнительным объективным критерием тяжести течения инфекционного процесса, а также позволяет дифференцированно судить об эффективности проводимой антибактериальной терапии и вносить необходимые коррекции в неё.
При остром и хроническом бронхитах у детей ведущими этиологическими факторами инфекционного процесса являются ассоциации вирусных и бактериальных патогенов и условно-патогенных микроорганизмов (УПМ). При остром бронхите нарушения сдвигаются в сторону дисбиоза и выраженного воспалительного процесса, сопровождающимися высокими уровнями как индигенной микрофлоры, так и УПМ, что свидельствует о выраженной КР. При хроническом бронхите не резко выраженное повышение перечисленных показателей свидетельствует о вяло текущем процессе. Обратная зависимость между показателями естественной и искусственной адгезий клеток буккального и назофаррингиального эпителиев свидетельствует о нарушении реакции рецепторов клеток эпителия на микроорганизмы и способствует преодолению микрофлорой колонизационного барьера. Взаимодействие TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8 с микрофлорой биотопа определяет колонизационную резистеность слизистых. Подтверждено, что при респираторной патологии у детей TLR-2 и TLR-4 реагируют преимущественно на бактериальные патогены, а TLR-3 и TLR-8 - на вирусные. Установлена достоверная взаимосвязь TLR с факторами врождённого иммунитета лизоцимом, индексом естественной колонизации назофарингиального эпителия (ИЕКНЭ), slgA и sc. Уровни IgE независимы от показателей экспрессии генов TLR.
Выявлена способность микрофлоры десневой жидкости больных паро¬донтозом продуцировать протеиназы, обладающие неспецифической и специ¬фической (по гидролизу исключительно IgAl человека) активностями.
Впервые комплексно оценена просветная и пристеночная микрофлора и показатели Ig секрета влагалища (Вл) клинически здоровых женщин и
пациенток с уреаплазменной микст-инфекцией. Выявлено резкое снижение КР, характеризующееся появлением и/или значительным увеличением в просветной и пристеночной областях ассоциаций условно-патогенных факультативно- (стрептококки, стафилококки, энтерококки, энтеробактерии, кандида) и облигатно-анаэробных микрооганизмов (пептострептококки, пептококки, гарднереллы, бактероиды, фузобактерии) и изменением показателей уровней Ig секрета Вл. Оценка содержания УПМ различной таксономической принадлежности в сопоставлении с уровнями Ig секретов позволяет оценивать степень дисбиотических нарушений микробиоценоза Вл. УПМ и грибы рода Candida обладают высокой резистентностью к антибактериальным и фунгицидным препаратам, изменяющейся в процессе лечения и отражающей его эффективность. При совместном применении иммуномодуляторов и антибактериальных препаратов повышается элиминимрующий эффект последних на возбудителей и задерживается селекция антибиотикорезистентных культур в процессе лечения.
При урогенитальном хламидиозе (УГХ) патогены и УПМ, попадая на слизистые урогенитального тракта (УГТ), взаимодействуют с TLR и запускают воспалительную реакцию. Различные уровни активации TLR-2 и TLR-4 зависят от качественного состава микробных сообществ, присутствующих на слизистой оболочке УГТ. Показатели уровней обсеменённости УПМ цервикального канала (Цк), уретры (Ур) и влагалища (Вл) прямо коррелируют с показателями уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4. Повышение экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в Цк и в Ур, коррелирует с тяжестью клинических проявлений. Во Вл имеет место экспрессия генов TLR-2 и TLR-4 в ответ на УПМ, а в Цк и Ур - на УПМ и возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). Активация экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 происходит более выраженно в ответ на патогены и УПМ и менее выражено - на нормофлору.
Естественная или приобретённая супрессия генов TLR-2 и TLR-4 обус-ловливает хроническое течение УГХ. Однотипные изменения показателей экс¬прессии генов TLR-2 и TLR-4 в Цк и Ур при хроническом УГХ указывают на
"феномен рецепторной депрессии", сопровождающегося дисбалансом между развитием инфекционного процесса и воспалительной реакцией. Уровни эксп¬рессии генов TLR-2 и TLR-4 служат критериями оценки выраженности УГХ и воспалительного процесса, а при выздоровлении их снижение свидетельствует об эрадикации возбудителя. При остром УГХ выявление низких уровней TLR-2 и TLR-4 указывает на начало хронизации инфекционного процесса.
Впервые показано, что неотъемлемой частью патологических проявлений при урогенитальном хламидиозе и уреаплазе на организменном и местном уровнях является повышенная восприимчивость к гетерологичным бактериальным и вирусным патогенам.
При невынашивании беременности одновременное достоверное увеличение числа ассоциаций и интенсивности колонизации УПМ, снижение IgG, IgA, IgM, IgA, slgA и sc во влагалище (Вл), полости рта и кишечнике свидетельствует о риске невынашивания беременности и служит объективным критерием состояния реактивности организма и качества жизни пациенток, имеет диагностический и прогностический характер. Наличие тесной связи между микробиоценозами Вл, полости рта и кишечника служит обоснованием необходимости проведения комплексного исследования и своевременной коррекции выявленных нарушений, что может свести к минимуму вероятность невынашивания беременности. Инфекционный, гормональный или смешанный генез невынашивания беременности определяет выраженность изменений микробиоценозов Вл, полости рта и кишечника. Высокая частота и степень выраженности дисбиотических нарушений и наличие тесной связи между биотопами свидетельствует о системных микроэкологических изменениях в организме беременной.
Микробиологическая характеристика желудочно-кишечного тракта пациентов с гнойными перитонитами позволяет объективизировать оценку тяжести течения, стадии развития патологического процесса, оценку патогенетических свойств микроорганизмов по выраженности у них антибиотикорезистентности и их устойчивости к антисептическим препаратам.
Выявлен пятилетний период четкой смены основного возбудителя нозокомиального инфицирования брюшной полости. Установлен 2-3-летний период в появлении устойчивых штаммов к антисептическим растворам, применяемым для этапных санаций брюшной полости. Степени антибиотикорезистетности, фагорезистетности и устойчивости к
антисептическим растворам выделенных штаммов при перитонитах - дополнительные критерии их патогенности. Отсутствует корреляция между антибиотико- и фагоустойчивостью. Впервые применённая при лечении перитонитов бактериофаготерапия исключает присоединение
внутрибольничной флоры и обеспечивает элиминацию из перитонеальной полости микроорганизмов, устойчивых к использованным ранее
антибактериальным препаратам. Терапевтическая эффективность фагового препарата повышается при подборе фагов к конкретному микроорганизму, выделенному от конкретного пациента.
Нозокомиальные штаммы Е. coli, Acinetobacter и псевдомонадных бактерий от больных с перитонитом высеваются в титре 106 lg КОЕ/г, что косвенно свидетельствует о приобретении ими патогенных свойств. Нозокомиальные штаммы обладают генами, отвечающими за адгезию бактериальных клеток к тканям макроорганизма, обеспечивающими размножение, антибиотикорезистентность и повышающими патогенность бактерий. Выявление островков патогенности (ОП), определяющих антибиотикорезистентность, в большинстве случаев совпадает с частотой выявления антибиотикорезистености диско-диффузионным методом. Тем не менее, выявление ОП, определяющих антибиотикорезистентность, у 30% штаммов не совпадает с частотой выявления антибиотикорезистентности in vitro, что свидетельствует о многоплановых генетических механизмах, её определяющих.
Впервые предложена молекулярно-генетическая методология, включающая мультиплексные ПЦР-тест-системы в режиме реального времени для верификации Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, плазмидных и
бесплазмидных штаммов СИ. trachomatis, а также генотипов СИ. trachomatis, что позволило выявить естественную системную хламидиозную инфекцию у низших обезьян. Впервые выявлена зависимость выраженности патологического процесса и клинических проявлений от наличия и сочетания отдельных патогенетических факторов (плазмиды, функционального состояния гена Inc А, принадлежности штамма хламидий к конкретному генотипу, одновременного инфицирования штаммами хламидий с разными генотипами).
Теоретическая значимость работы
Научно обоснована и подтверждена концепция о том, что взаимодействие микробиоценозов слизистых открытых полостей макроорганизма носит динамический характер, обеспечивает жизненно необходимый оптимальный уровень реактивности макроорганизма и его антиинфекционную резистеность. Тем самым, достоверно подтверждена роль микроорганизмов в обучении защитных систем макроорганизма в онтогенезе. Изменение антиинфекционной резистентности к гетерологичным патогенам на организменном и местном уровнях определяется набором факторов патогенности микроорганизмов, яв¬ляющихся неотъемлемой патогенетической характеристикой возбудителей ин¬фекций, обусловливающей, в конечном счёте, прогноз и исход заболевания.
Расширены представления о механизме формирования запуска инфекци¬онного процесса, который является следствием взаимодействия микроорганиз¬мов биотопов слизистых и возбудителей инфекционных заболеваний с TL- рецепторами, уровень экспрессии которых взаимосвязан с выраженностью по¬казателей местного иммунитета (секреторных иммуноглобулинов и цитокинов).
Предложены теоретические основы и разработаны критерии комплексной оценки состояния микроэкологии и гуморального иммунитета слизистых от¬крытых полостей человека в норме и при инфекционной патологии.
Представленный в диссертации метод комплексной оценки позволяет ди¬агностировать степень микроэкологических нарушений, выявить этиологиче¬ский фактор и прогнозировать тяжесть течения инфекционного процесса, про-
водить эффективные лечебно-профилактические мероприятия с целью элими¬нации возбудителей инфекции и восстановления микроэкологии и колонизаци¬онной резистености экосистем слизистых открытых полостей.
Практическая значимость работы
Впервые представлен алгоритм функционирования КР слизистых как ин¬тегральной составляющей местной антиинфекционной резистентности и муко¬зального иммунитета в целом. Предложенный запатентованный способ оценки КР слизистых можно рассматривать как метод оценки их мукозального имму¬нитета. Регистрация показателей уровней TLR, цитокинов и Ig слизистых имеет диагностическое и прогностическое значение, а также позволяет судить об эра- дикации патогена.
Предложен универсальный молекулярно-генетический подход оценки па¬тогенетических механизмов инфекционного процесса на организменном уровне и с учётом факторов патогенности возбудителя заболевания.
Впервые обоснованы принципы бактериофаготерапии перитонитов, отя¬гощённых присоединением нозокомиальных микрорганизмов.
При бронхитах пятикратное повышение уровней экспрессии генов TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8 и цитокинов IL-ip, IL-8, INF-y, TNF-a свидетельствует об остром течении инфекционного процесса и хорошей местной антиинфекцион¬ной резистентности, а отсутствие повышения - о хроническом течении и нару¬шении местной антиинфекционной резистентности, что имеет диагностическое и прогностическое значение.
При УГХ выявление в соскобном материале из Ур уровней экспрессии генов TLR-2 более 14 ОЕ и TLR-4 более 10 ОЕ, а в соскобном материале из Цк

bibliography

Выводы
1. Определены показатели нормоценоза и критерии оценки микроэкологических нарушений, включающие видовой и количественный состав микрофлоры и уровни основных классов иммуноглобулинов в секретах (IgG, IgM, IgA, slgA и sc), отражающие состояние колонизационной резистентности биотопов слизистых открытых полостей.
2. Смешанное бактериально-вирусное инфицирование при респираторной патологии сопровождается повышением уровней индигенной микрофлоры и условно-патогенных бактерий. Обнаружение нескольких видов или монокультур условно-патогенных микроорганизмов в титре 6,0 lg КОЕ/г и выше является признаком выраженного воспалительного процесса ротоглотки, обусловленного доминирующей условно-патогенной микрофлорой. Дисбиоз ротоглотки у детей без признаков острой инфекции на момент обследования является показанием к тщательному клиническому обследованию пациентов.
3. При бронхитах у детей определена взаимосвязь уровней экспрессии мРНК TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8 и инфекционной нагрузки. В результате активизируется местный цитокиновый каскад, запускающий иммуноглобулиновое звено и воспалительную реакцию в ротоглотке. Уровни IgE независимы от показателей экспрессии генов TLR. По сопоставлению естественной и экспериментальной колонизации эпителиальных клеток букального и назофарингеального эпителиев тест-штаммами можно судить о степени нарушения колонизационной резистентности дыхательных путей.
4. При уреаплазменной и хламидийной инфекции в зависимости от выраженности инфекционного процесса (дисбиоз или бактериальный вагинит) снижаются уровни индигенной микрофлоры, увеличивается содержание условно-патогенных факультативно-анаэробных микроорганизмов в просветной области и облигатно-анаэробных микроорганизмов в пристеночной области. Высеваемость условно-патогенной микрофлоры в титре 7 lg КОЕ/г и выше во влагалище и 4 lg КОЕ/г и выше в цервикальном канале
свидетельствует о её патогенности. При обострении хронического процесса патогенный потенциал микрофлоры реализуется при титре 5 lg КОЕ/г во влагалище и 4 lg КОЕ/г и выше в цервикальном канале.
5. При уреплазмозе колонизационная резистеность слизистых урогенитального тракта характеризовалась корреляционной зависимостью между содержанием индигенной и условно-патогенной микрофлоры и уровнями IgG, IgA, slgA, IgM и sc в отделяемом; при хламидиозе выявлена взаимосвязь уровней экспрессии мРНК генов TLR-2 HTLR-4 на слизистых урогенитально тракта с цитокинами, уровнями IgG, slgA и sc и микрофлорой биотопа, что определяло выраженность местной воспалительной реакции.
6. Установлено, что внутриклеточные патогены (хламидии, уреаплазмы) способны изменять антиинфекционную резистентность макроорганизма к гетерологичным возбудителям. Оценка антибиотикорезистентности и фагорезистентности как фактора патогенности уреаплазм, хламидий, возбудителей нозокомиальных инфекций и условно-патогенных бактерий при наблюдении пациентов в динамике при уреаплазмозе, хламидиозе и гнойных перитонитах носит диагностический и прогностический характер.
7. Впервые выявлено, что сочетание наличия плазмиды и высокой активности гена incA определяет вирулентность штаммов Ch. trachomatis. Для нозокомиальных штаммов, полученных от больных с перитонитом, характерно наличие одного или нескольких генов, отвечающих за адгезию, размножение и антибиотикорезистентность бактерий.
8. При беременности, осложненной невынашиванием на ранних сроках, зарегистрирован повышенный уровень инфекционной нагрузки и достоверное снижение уровня основных классов иммуноглобулинов в биотопах влагалища, ротоглотки и кишечника, что свидетельствует о степени нарушения местной иммунологической резистентности.
9. Выявлены микроэкологические изменения равной степени тяжести
одновременно в биотопах влагалища, полости рта и кишечника у 32% пациенток с сохраненной беременностью, у 50% - с прервавшейся
беременностью и у 30% - клинически здоровых беременных, что
свидетельствует о системном характере дисбиотических нарушений.
10. Впервые представлен алгоритм формирования и оценки функцио-нального состояния колонизационной резистетности слизистых открытых по¬лостей: TL-рецепторы слизистых реагируют на патогены, условно-патогенную микрофлору и нормофлору, через цитокиновую систему запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни секреторных иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA, slgA и sc), что в комплексе составляет колонизационную рези¬стентность.
Практические рекомендации
1. При диагностике и установлении прогноза течения инфекционных за¬болеваний открытых полостей организма необходимо и целесообразно оцени¬вать выраженность дисбиотических нарушений ротоглотки, кишечника, влага¬лища и цервикального канала, а также колонизационную резистентность слизи¬стых биотопов как интегральный показатель местной антиинфекционной рези¬стентности и неотъемлемой части мукозального иммунитета.
2. Для полноценной оценки инфекционных процессов необходимо одно¬временно учитывать динамику показателей устойчивости к антибиотикам и хи¬миопрепаратам патогенов, индигенной и УПМ биотопов слизистых.
3. Общепринятый алгоритм верификации возбудителя хламидийной ин¬фекции необходимо расширить за счёт включения предложенных оригиналь¬ных мультиплексных ПЦР-тест-систем на одномоментное дифференцирование Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae, одномоментное дифференцирование плазми¬досодержащих и плазмидонегативных штаммов Ch. trachomatis, а также на ге¬нотипы Ch. trachomatis и выявление «островков патогенности», определяющих антибиотикорезистетность штаммов хламидий.
4. При распространенных гнойных перитонитах целесообразно примене¬ние препаратов бактериофагов, бактериофаги обеспечивают профилактическую защиту реинфицирования брюшной полости нозокомиальными штаммами.