АГЕЙЧЕНКО АЛИНА ВЛАДИМИРОВНА СОСТОЯНИЕ МИКРОБИОЦЕНОЗА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА, ЛИПИДНОГО СОСТАВА КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН И АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА ЖИВОТНЫХ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДИСБИОЗЕ

Краткое содержание

Эксперимент проводили на 400 мышах линии BALB/c массой тела 18-20 граммов. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента проводили с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите прав позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, Франция, 1986), правил лабораторной практики РФ (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003). Для решения поставленных задач животные были разделены на 8 групп (по 50 мышей в каждой). Первая группа - контрольная (интактные мыши). Вторую группу составили животные, у которых моделировали лекарственный дисбиоз путём однократного ежедневного (в течение 5 дней) внутрибрюшинного введения раствора гентамицина. Концентрация вводимого антибиотика составляла 80 мкг/мл в пересчёте на массу животного. В третью группу входили мыши, которым с профилактической целью внутримышечно вводили антиоксидант эмоксипин в рекомендуемой дозе 167,18 мг/кг в пересчёте на массу животного в течение 10 суток до начала моделирования дисбиоза. Четвертой группе животных с целью коррекции внутримышечно вводили антиоксидант эмоксипин в дозе 167,18 мг/кг в пересчёте на массу животного в течение 10 суток после формирования дисбиоза. Мышам пятой группы по окончанию введения антибиотика интрагастрально вводили пробиотик «РиоФлора Иммуно Нео» в течение трех недель. Шестую группу составили животные, которым после формирования лекарственного дисбактериоза вводили антиоксидант эмоксипин (внутримышечно в течение 10 суток) и пробиотик «РиоФлора Иммуно Нео» (интрагастрально в течение 21 дня). Мыши седьмой группы после формирования дисбиоза интрагастрально получали пробиотик «Бифиформ» в терапевтической дозе в течение 21 дня. Восьмую группу составили животные, которым после формирования лекарственного дисбактериоза вводили антиоксидант эмоксипин (внутримышечно в течение 10 суток) и пробиотик «Бифиформ» (интрагастрально в течение 21 дня).
Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстого кишечника
Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей проводилось по методике Кафарской Л.И. и Коршунова В.М. [Богданова Е.А., Несвижский Ю.В., Воробьев А.А., 2006; Воробьев А.А. и др., 2005]. Биоптаты слизистой оболочки толстого кишечника освобождались от химуса и взвешивались в стерильных условиях. После этого материал помещался в стерильный раствор фосфатного буфера рН 7,0 в соотношении 1:10 и выдерживался в нём 2 часа для разжижения муцина. Затем из исследуемого материала готовились мазки, которые окрашивались по Граму, и производилось разведение исследуемого материала до концентраций 10" -10" . По 0,1 мл каждого разведения взвеси засевали газоном на поверхность питательных сред (Эндо, Сабуро, SSA-агар, ЦПХ-агар, кровяной агар, желточно-солевой агар, висмут-сульфит агар, лактоагар, бифидоагар) и инкубировали при температуре 370С в аэробных и анаэробных условиях. Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью микробиологического анализатора «Multiskan-Ascent» и коммерческих тест систем: ЭНТЕРОтест-16, СТАФИтест-16, Стрептотест-16, Эн- КОККУСтест-16 («Лахема» (Чехия)); API 50 CHL - для идентификации лактобацилл и бифидобактерий («Биомерье»). Количество бактерий в 1 грамме материала рассчитывали исходя из числа выросших колоний микроорганизмов - колониеобразующих единиц (КОЕ) при посеве из максимального разведения, где отмечался рост не менее 10 колоний, учитывая при этом объём посевного материала. Для расчёта использовали формулу: К=Е/К^*П, где К - колониеобразующая единица, Е - общее количество бактерий, к - количество внесённого материала, v - количество чашек Петри, n - разведение. Удельное содержание микроорганизмов вычисляли как количество микроорганизмов, выделенных из биопроб, и выражали как lg КОЕ/г массы биологического материала [Воробьев А.А. и др., 2005; Несвижский Ю.В. и др., 2007; Дж. Хоулт, Н. Криг, П. Снит, 1997; Воробьев А.А. и др., 2005].
Определение продуктов ПОЛ и ферментов АОЗ организма
Для определения промежуточного продукта ПОЛ - ацилгидроперекисей (АГП) к 0,2 мл гомогената ткани толстого кишечника или плазмы крови добавляли 6 мл смеси гептана и изопропанола, а затем 1 мл соляной кислоты и интенсивно встряхивали. После расслоения фаз отбирали гептановый слой, в котором спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра «Apel 330 PD» (Япония), измеряли содержание ацилгидроперекисей при длине волны 233 нм против контрольной пробы и выражали в условных единицах [Макаренко Е.В., 1988, Королюк М.А. и др., 1988].
При количественном анализе малонового диальдегида (МДА) к 0,02 мл исследуемой пробы добавляли 0,5 мл смеси тиобарбитуровой и уксусной кислоты в соотношении 1:1, а затем инкубировали 60 минут при температуре 100оС. Измеряли оптическую плотность при 532 нм с использованием спектрофотометра «Apel 330 PD» (Япония) и рассчитывали количество малонового диальдегида с помощью наборов «ТБК-Агат». Результаты выражали в мкмоль/г белка ткани в гомогенате ткани кишечника и мкмоль/л в плазме крови [Макаренко Е.В., 1988; Королюк М.А. и др., 1988; Рагино Ю.И., Душкин М.И., 1998].
Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) к 0,02 мл экстракта гомогената ткани толстого кишечника или плазмы крови вводили в 3 мл инкубационной среды, содержащей 0,41 мМ нитросинего тетразолия, 0,33 мМ ЭДТА, 0,01 мМ^метилфеназония метилсульфата. Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре «Apel 330 PD» (Япония) при длине волны 540 нм, затем добавляли в кювету 0,1 мл 0,8 мМ НАД-Н, перемешивали и оставляли в темноте на 10 мин, после чего повторно измеряли оптическую плотность. О реакции судили по разнице между первым и вторым показаниями спектрофотометра. За условную единицу активности СОД принимали 50% торможение реакции восстановления нитросинего тетразолия [Макаренко Е.В., 1988, Королюк М.А. и др., 1988].
Для определения активности каталазы к 0,1 мл гомогената ткани толстого кишечника или плазмы крови добавляли 2,0 мл 0,03% раствора перекиси водорода. После 10-минутной инкубации при 37оС останавливали реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Интенсивность окраски измеряли фотометрическим методом при длине волны 410 нм с использованием спектрофотометра «Apel 330 PD» (Япония). Активность каталазы рассчитывали
F -F -31
*-*хол ^оп -*»1
по формулеА (мкат/л) = UP-22,2-10 ^ выражали в мкат/г ткани в гомогенате ткани толстого кишечника или мкат/мл в плазме крови [Королюк М.А. и др., 1988].
Количественное и качественное определение липидных фракций мембран эритроцитов
Экстракцию липидов проводили из чистой эритроцитарной массы в количестве 0,5 мл при помощи последовательного добавления 0,5 мл дистиллированной воды, 5,5 мл изопропанола и 3,5 мл хлороформа с промежутком времени в один час, интенсивно перемешивали на вибромешалке. После чего, полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр [Кузнецов В.И., Миронова Н.И., 1996]. Полученный фильтрат липидов мембран эритроцитов использовали для фракционирования фосфолипидов и нейтральных липидов [Ольшанова К.М., 1970].
Хроматографирование проводили по методу Крылова В.И. [Э. Кец, 1990; Крылов В.И., Виноградов А.Ф., Ефремова С.И., 1984]. Для хроматографирования фосфолипидов использовали систему элюэнтов: хлороформ:метанол:аммиак в соотношении 65:35:5, а для нейтральных липидов - гептан:петролельный эфир:ледяная уксусная кислота в соотношении 60:40:4. Фракционирование липидов проводили при комнатной температуре: фосфолипидов дважды, а нейтральных липидов однократно до поднятия растворителя до линии финиша [Э. Кец, 1990; Крылов В.И., Виноградов А.Ф., Ефремова С.И., 1984; Кузнецов В.И., Миронова Н.И., 1996; Сафонова Е.Ф., Назарова А.А., Селеменев В.Ф., 2002].
Для идентификации применяли стандартные образцы нейтральных липидов и фосфолипидов производства фирмы «Sigma» (USA), уровень содержания липидов определяли денситометрическим методом на ПВМ IBM PA/AT с
использованием программы «OneDscan» в отраженном свете [Алесковский В.Б., Бардин В.В., Булатов М.И., 1988, Э. Кец, 1990; Крылов В.И., Виноградов А.Ф., Ефремова С.И., 1984; Кузнецов В.И., Миронова Н.И., 1996].