БУРМЕНСКАЯ Ольга Владимировна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ

Краткое содержание

Разработка систем для определения транскрипционных профилей генов иммунной системы
Задача данного этапа диссертационной работы состояла в формировании, разработке и клинической адаптации тест-систем для количественного определения уровня экспрессии мРНК выбранных генов-маркеров, включая оптимизацию методов выделения РНК и ДНК, метода обратной транскрипции, подбор, проверку и оптимизацию температур отжига олигонуклеотидных праймеров и проб, характеристику используемых тест-систем.
Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб
Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб (ДНК-зондов) осуществляли путем анализа последовательностей ДНК и мРНК генов базы данных NCBI (http//www.ncbi.nlm.nih.gov). В реакции обратной транскрипции использовали специфичные олигонуклеотиды 12-15 п.н., которые обеспечивали более высокую эффективность реакции по сравнению со случайными гексамерами и поли-Т- нуклеотидами. При подборе праймеров и зондов учитывали структурную организацию генов, кодирующих мРНК, чтобы исключить отжиг праймеров на геномной ДНК, а также наличие псевдогенов и различные варианты альтернативного сплайсинга.
Проверка праймеров и зондов
Проверку праймеров и зондов для ПЦР проводили на панели образцов, включающей: образцы, прошедшие реакцию обратной транскрипции (кДНК); отрицательный контрольный образец, прошедший пробоподготовку и реакцию обратной транскрипции; образцы, не прошедшие реакцию обратной транскрипции (геномная ДНК).
Критерии приемлемой тест-системы были следующие: 1. Наличие
амплификации в образцах, прошедших реакцию обратной транскрипции. 2. Отсутствие на форезе дополнительных неспецифичных полос. 3. Амплитуда разгорания флуоресцентно-меченных проб не менее чем в 2 раза по отношению к фону. 4. Эффективность амплификации не менее 90%. 5. Отсутствие амплификации в отрицательном контрольном образце. 6. Отсутствие амплификации на геномной ДНК.
Отсутствие амплификации на геномной ДНК позволило в рутинной практике значительно упростить методику: выделять суммарный пул нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), не использовать дополнительный этап обработки проб ДНК-азой, сократить число пробирок при постановке реакции амплификации за счет исключения из контроля образцов, не проходящих реакцию обратной транскрипции.
Всего было разработано 28 тест-систем для определения экспрессии генов иммунного ответа (IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL15, IL18, IL23A, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189, TBX21, GATA3, RORC, Foxp3, TLR2, TLR4, TLR9, IL2Ra, CD45, CD68) и 4 референсных генов (B2M, HPRT1, TBP и GUSB).
Разработанные тест-системы были апробированы на образцах тканей секреторного и пролиферативного эндометрия. Выбор был обусловлен наличием четких гистологических критериев, позволяющих различать эндометрий пролиферативной и секреторной фаз менструального цикла.
Апробация метода исследования транскрипционных профилей в образцах тканей эндометрия двух стадий менструального цикла
Задача данного этапа работы состояла в оценке возможности сравнительного анализа транскрипционных профилей в пролиферативном и секреторном эндометрии, а также поиске способов дискриминации образцов в зависимости от стадии менструального цикла на основе изучаемых маркеров.
В соответствии с полученными результатами для эндометрия секреторной фазы характерно повышение таких маркеров, как LIF в 2,5 (р=0,031), IL6 в 2,7 (р=4,7х10-4), TLR4 в 2,7 (р=1,8х10-5), VEGFA изоформа 189 в 3,1 (р=0,002), TNF в 2,2 (р=0,004), IL4 в 1,4 раза (р=10-10) и снижение таких маркеров, как Foxp3 в 2,6 (р=8,7х10-5), IL2 в 8,1 раз (р=0,015) по сравнению с пролиферативным эндометрием (рис.1).
На основании экспериментальных данных по экспрессии генов с помощью методов статистического анализа были выбраны 5 наиболее информативных маркеров, которые позволили различить пролиферативный и секреторный эндометрий, рассчитаны индексы соотношения экспрессии генов. Основное требование к паре показателей, составляющих индекс, состояло в разнонаправленном характере изменения экспрессии в группе исследования.