ФАРМАКОЛОГІЧНА КОРЕКЦІЯ НЕУСКЛАДНЕНИХ ГІПЕРТЕНЗИВНИХ КРИЗІВ АНТИГІПЕРТЕНЗИВНИМИ ПРЕПАРАТАМИ ДЛЯ АПЛІКАЦІЙНОГО ЗАСТОСУВАННЯ

Краткое содержание

      Об’єкт та методи дослідження й лікування. Для вирішення поставлених завдань в дослідженні використані лабораторні тварини: 420 білих щурів зі спонтанною АГ та 120 нормотензивних щурів лінії Вістар масою 180-250 г, отриманих з віварію “ Столбовая ” Московської області (Російська Федерація), а також 16 безпородних котів масою 2,8-3,5 кг. Тварин утримували в умовах віварію ЗДМУ на стандартному раціоні. Робота із тваринами проводилась з дотриманням вимог директиви 86/609/ЕЕС з питань захисту тварин, а також “Методических указаний по выведению лабораторных животных из эксперимента” (Киев,1986). Комітетом з біоетики ЗДМУ ( протокол № 3 від  17квітня 2008 р.) встановлено, що дослідження не суперечать загальноприйнятим етичним нормам.

      Вибір використаних у роботі моделей експериментальної патології базувався на конкретних завданнях дослідження. У зв’язку з відсутністю експериментальних моделей ГК, із різноманіття описаних у літературі методів відтворення церебральної ішемії ми зупинилися на легко відтворюваній моделі у вигляді однобічної перев’язки загальної сонної артерії у білих щурів (Albano C. et al., 2005). Для наближення моделі до досліджуваного стану проводили однобічну перев’язку загальної сонної артерії у щурів зі спонтанною АГ. Штучну АГ моделювали у щурів шляхом екстирпації однієї нирки та лігатурної оклюзії контралатеральної ниркової вени більш ніж на 50% від вихідного діаметра. Через 30 днів у всіх тварин відзначалися ознаки ГК, що проявлялося додатковим підвищенням АТсер. до 132,51±8,83 мм рт.ст. (контроль – 126,11±9,13 мм рт.ст.).

      Лівошлуночкову серцеву недостатність ( модель кардіального ГК)  моделювали у гіпертензивних щурів внутрішньовенним введенням водного розчину тіосечовини (100 мкг/кг) та адреналіну  в дозі 0,15 мг/кг, що, у певній мірі, гемодинамічно відтворювало “перевантаження” об’ємом і тиском ЛШ (Colmenero M. et al., 2005).

     Для вивчення впливу лікарських форм вазодилататорів на АТ і ЧСС у якості апаратури виміру використовували поліграф “Салют” (Російська Федерація) з тензометричними катетерами та графічною реєстрацією САТ, ДАТ, АТ сер. та ЧСС на самописці багатоканального реєстратора. Вимірювання гемодинамічних показників проводили через 30-60 хвилин після маніпуляцій для стабілізації гемодинаміки. В якості контролю використовувалася методика «хибного оперування» із нанесенням на слизову оболонку плацебо у відповідній лікарській формі.

    Для реєстрації кровонаповнення структур головного мозку застосовували метод імпедансної реографії (Демченко И.Т.,1976). Усі показники фіксувались при синхронній прямій реєстрації в динаміці експериментальної терапії. Препарати піддослідним тваринам наносили аплікаційно на слизові оболонки: натрію нітропрусид – буккально в дозі 150 мкг/кг; німодипін –інтраназально в дозі 2 мг/кг; еналаприлу малеат – ректально в дозі 5 мг/кг. Дози препаратів відповідають діапазону доз для людини з урахуванням коефіцієнту перерахунку на щурів (Вікторов А.П.,2007).

      В клінічних умовах обстежено 533 хворих на АГ ІІ стадії високої категорії додаткового серцево-судинного ризику зі  схильністю до розвитку неускладнених ГК, які дали письмову згоду на участь у дослідженні. Вони були розподілені на дві клінічні групи в залежності від домінуючих клінічних проявів неускладнених ГК. Обстеження проводили на базі Запорізького клінічного кардіологічного диспансеру і Запорізької багатопрофільної клінічної обласної лікарні. Діагнози АГ і ГК верифікували відповідно до рекомендацій ESN/TSC та Української асоціації кардіологів з профілактики та лікування артеріальної гіпертензії (2007). Критерії виключення з груп дослідження: хворі на АГ із систолічною дисфункцією ЛШ (ФВ<45%), судинними подіями в анамнезі (інфаркт міокарда, гостре порушення мозкового кровообігу), цукровим діабетом, системними захворюваннями сполучної тканини, документованою ішемічною хворобою серця, ХОЗЛ, клапанними вадами серця, симптоматичними АГ, порушеннями серцевого ритму й провідності

      І клінічну групу склали 393 хворих зі схильністю до розвитку  неускладнених церебральних ГК, асоційованих із гіпертензивною ремодуляцією брахіоцефальних артерій, у клінічній картині котрих на висоті клінічних проявів кризу домінували загально-мозкові симптоми без ознак неврологічного  дефіциту, віком від 22 до 76 років, з них 183 (47,32 %) – чоловіки,  210 (52,67 %) – жінки. Розподіл обстежених   хворих був порівняним за статтю, віком та тривалістю гіпертензивного анамнезу. За ступенем тяжкості сумарної асиметрії лінійної швидкості кровотоку (ЛШК) у контралатеральних брахіоцефальних артеріях (БЦА) хворі розподілялися на три підгрупи: з гемодинамічно несуттєвими (сумарна асиметрія ЛШК у межах 30-50%), граничними (сумарна асиметрія ЛШК у межах 51-70%) та гемодинамічно значущими (сумарна асиметрія ЛШК понад 71%) порушеннями кровообігу.

    В ІІ клінічну групу ввійшло 140 пацієнтів зі схильністю до розвитку кардіальних ГК на тлі ремодульованого міокарда ЛШ із серцевою недостатністю III ФК (класифікація NYHA) за діастолічним варіантом зі збереженою скоротливою функцією лівого шлуночка: з них 72 (51,4%)– чоловіки, 68 (48,6%) – жінки. У клінічній картині хворих з кардіальними ГК переважали скарги на інспіраторну задишку, тахікардію і кардіалгію різної тривалості та інтенсивності на тлі додаткового підвищення АТ понад 20% від звичного рівня. За індексом маси міокарда лівого шлуночка (ІММЛШ) хворі розподілялися на три підгрупи: з ІММЛШ у межах 125-140, 141–160,  понад 161 г/м².

     Дослідження проведені на висоті клінічних проявів кризу, через добу та після двотижневої моно- та комбінованої терапії в клініках, які є клінічними базами Фармакологічного центру МОЗ України. Еналарект вивчався впродовж 12-ти тижнів. Дослідження проводилось як відкрите, порівняльне і контрольоване в трьох групах: дослідження, порівняння і контролю.

    В контрольну групу ввійшли 44 хворих на АГ ІІ стадії високої категорії ризику в позакризовому стані з сумарною асиметрією ЛШК у БЦА до 30%.

     Рентгеноконтрастна ангіографія виконувалась на ангіографічному комплексі «Arcogem» (General Electric, США). Вплив препаратів на брахіоцефальний і церебральний кровоток аналізували методом кольорової дуплексної допплерографії на апараті Vivid-3 Expert, General Electric, США; (Гельцер Б.И. с соавт.,2004); на стуктурно-функційні показники ЛШ серця – ехокардіографічно за загальноприйнятою методикою в М, В та 2D режимах (Maron B.J.,2005); на функції ендотелію і нирковий кровоток – методом імпульсно-хвильової допплеросонографії високого ступеня вимірювання на приладі Sonolain-450(Німеччина) за загальноприйнятою методикою (Kerut E.K.,2005) 

     Ефективність антигіпертензивної терапії оцінювали за допомогою добового моніторування АТ (ДМАТ) на приладі АВРМ-02 фірми Meditech (Угорщина). Добове моніторування ЕКГ здійснювали на приладі Інкарт-4000 (Російська Федерація) за стандартними методиками у кризовому стані і через 2 тижні монотерапії (Домницкая Т.М., 2002, Mallion J., et al. 2005).

     Для вивчення стану енергетичного обміну в тканинах мозку, серця й у крові вивчали рівень глюкози і глікогену, пул макроергів (АТФ, АДФ, АМФ), вміст пірувату і малату; активність ізоензимів креатинфосфокінази (МВ,ВВ) біохімічними методами (Стальная И. Д., 1977; Яровая Г.Я. с соавт., 1982; Захаров Н.Б., Рубин В.Н.,1980). Рівень оксидативного стресу визначали за балансом пероксидації ліпідів та антиоксидантного потенціалу крові (Гаврилова А.Р.,1982; Дубинина Е.Е.,1983; Королюк М.А. с соавт.,1988; Андреева Л.И. с соавт.,1988; Беленичев И.Ф.,1992). Вміст макроергічних фосфатів і метаболітів позначався в мкмоль/г неопрацьованої тканини, активність ферментів – у ммоль /субстрату на мг білку у хвилину.

     Визначення вивільнення субстанції натрію нітропрусиду з аплікаційних лікарських форм  проводили методом рівноважного діалізу в очищену воду. Концентрацію субстанції натрію нітропрусиду визначали фотоколометричним методом через 15, 30, 45, 60 та 90 хв. (АС №1551085, СРСР).

     Динаміка вивільнення субстанції німодипіну в рецепторне середовище досліджувалась in vitro за допомогою “кошика, який хитається”. Концентрацію німодипіну визначали флуометричним методом. В якості середовища розчинення використовували універсальну буферну систему із рН 7,4. Температура середовища розчинення становила 37±2˚С. Через кожні 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 та 180 хв. відбирали проби середовища розчинення. Вимірювали оптичну щільність у порівнянні з контролем, в якості котрого використовували середовище розчинення з таблеток  німодипіну через рівні проміжки часу.

     З метою вивчення компонентів контактної системи фактора Хагемана використовували експрес-метод одночасного визначення in vitro показників інгібіторної, згортаючої, фібринолітичної та кінінової систем крові (Крашутский В.В., Бабаниязов Х.Х., 1987). Окремі компоненти калікреїн-кінінової системи в плазмі крові і добовій сечі досліджені за методикою Т.С. Пасхіної і  В.Ф.Нартикової (1987).

      Статистична обробка результатів проводилася згідно з вимогами щодо проведення біостатистичних досліджень (Бабіч П.Н., Єфімцева Т.І.,2006). Спочатку проводили перевірку гіпотези про нормальний розподіл варіант (побудова гістограм з накладанням кривої нормального розподілу). Далі застосовували однофакторний дисперсійний аналіз незбалансованого плану. Оцінка значущості показників по групах проводилася за критерієм Ст’юдента. Значущими вважали ті показники, у яких рівень відмінностей становив 5%. При асиметричному розподілі  використовували ранговий тест Вілкоксона. Порівняння показників, які рахувались у відсотках, здійснювали за допомогою тесту Фішера. Для аналізу зв’язку між показниками застосовували метод регресійного і кореляційного аналізів. Силу зв’язку між двома змінними визначали за допомогою лінійних кореляцій Пірсона і Спірмана. Значущими вважали ті показники, у яких рівень відмінностей становив 5%.   

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

     Експериментальна частина роботи. Для визначення впливу допоміжних речовин на динаміку вивільнення субстанцій з аплікаційних лікарських форм використовували: ректальні супозиторії, інтраназальний гель і буккальні полімерні плівки. Встановлено, що оптимальну швидкість вивільнення субстанції натрію нітропрусиду з аплікаційних композицій мають  полімерні плівки на основі карбоксиметилцелюлози з пропіленгліколем у якості пластифікатора, що дає змогу мати в крові швидкий та пролонгований ефект, а це має більш важливе значення для клінічних умов. Так, уже через 30 хв. від початку процесу в діалізній рідині із плівок вивільнялося 50% субстанції, через 90 хв. – 94%, з гелю – 37,4% та 71%, із супозиторіїв – 15,6%  та  34,5% субстанції відповідно (p<0,05).

     При вивченні фармакокінетичних параметрів вивільнення субстанції натрію нітропрусиду з аплікаційних композиції встановлено, що полімерні плівки мають суттєві переваги перед інтраназальним гелем. Так, константа швидкості всмоктування субстанції натрію нітропрусиду з плівок становила 1,08 хв^-1 (0,76 хв^-1 – для гелю); прихований час вступу – 0,60 хв. (для гелю – 2,0 хв., p<0,005); період напіввсмоктування – 0,64 хв. (для гелю – 0,92 хв., p<0,01); час досягнення достовірного зниження АТ під впливом плівок  становила 2,82 хв. (для гелю – 3,70 хв., p<0,05); площа під фармакокінетичною кривою для плівок була 3212,6  мм²  (для гелю – 2528,8 мм², p<0,005); абсолютна біодоступність субстанції натрію нітропрусиду з плівок становила 85,1%, (для гелю – 67%, p<0,05).

     При дослідженні динаміки вивільнення субстанції німодипіну в рецепторне середовище встановлено, що концентрація німодипіну на етапі дифузії речовини з гелю з пропіленгліколем поєднується з різким підвищенням його концентрації у середовищі розчинення і досягає максимального вмісту на 30 хв. (88-90% субстанції), далі врівноважується.

     При дослідженні фармакокінетики аплікаційних лікарських форм німодипіну встановлено, що константа швидкості всмоктування субстанції при інтраназальному застосуванні майже вдвічі перевищує такий показник для таблеток. Константа швидкості елімінації субстанції німодипіну після інтраназального призначення була в 1,5 раза вище, ніж після призначення таблеток, і майже вдвічі повільніша елімінації речовини після внутрішньовенного застосування. Про швидше звільнення організму від інтраназального німодипіну свідчить і величина загального кліренсу: цей показник для гелю майже в 2,5 раза перевищував значення при внутрішньовенній інфузії німотопу. Найвищий кліренс німодипіну зареєстрований при пероральному призначенні. Максимум вмісту німодипіну в крові після інтраназального призначення майже в 1,6 раза перевищує такий при пероральному призначенні і досягається в 1,4 раза швидше, ніж після прийому таблеток німотопу. Після внутрішньовенного болюсного введення спиртового розчину німодипіну (німотоп, „Bayer AG” ФРН) речовина повністю надходила до загального кровообігу, досягаючи максимуму вмісту в крові в 1,13 раза швидше, ніж після трансмукозного застосування гелю та у 1,6 раза швидше, ніж після введення таблеток з еквімолярною дозою субстанції німодипіну тієї ж фірми. Шляхом порівняння площі під фармакокінетичними кривими встановлено, що ступінь абсолютної біологічної доступності німодипіну у формі інтраназального гелю становила 40,3%, таблеток «німотоп» – 23,25% (p<0,05). Це свідчить, що гель на компонентній основі являє собою більш перспективну аплікаційну лікарську форму для подальших досліджень. 

    Для прогнозування впливу на АТ лікарських форм з еналаприлом будували лінії тренда за методом найменших квадратів для розрахунку коефіцієнтів детермінації, які дозволяють розрахувати величину АТ після введення лікарських форм еналаприлу малеату в будь-який момент часу (Глянц С., 1998). Для математичного моделювання впливу еналаприлату й еналаректу на АТ були використані поліноми 5 ступеня, для едніту – поліном 6 ступеня. Встановлено, що коефіцієнт детермінації (R²) для ректальних супозиторіїв з еналаприлом "еналарект" становив 0,9659; для офіцинального розчину "еналаприлат" – 0,5776; для таблеток "едніт" – 0,933. Отримані результати добре апроксимують експериментальні дані, на що вказують високі значення коефіцієнта детермінації для еналаректу та едніту, що збігається з літературними даними  (Lu S., et. al., 2009).

     На підставі проведених досліджень зроблено висновок, що перспективнішими для трансмукозного аплікаційного застосування за фармакокінетичними  параметрами є полімерні плівки для буккального застосування з натрію нітропрусидом (ніпруцел); інтраназальний гель з німодипіном (гель-німодипін); ректальні супозиторії з еналаприлом малеатом (еналарект).

    При вивченні експериментальної фармакодинаміки ніпруцелу встановлено, що у гіпертензивних щурів при моделюванні церебральних ГК препарат проявляє достовірну гіпотензивну дію з 5 по 40 хв. на тлі адекватного збільшення кровонаповнення півкуль головного мозку. Максимум гіпотензивної дії ніпруцелу зареєстровано на 10 хв. аплікації препарату. Динаміка впливу аплікаційних препаратів на АТ сер. представлена на рис.1.

Під впливом аплікації ніпруцелу кровонаповнення судин півкуль головного мозку в інтактних нормотензивних щурів підвищується з 5 по 20 хвилину максимально на 25,5±1.60% (p<0,05), у гіпертензивних – на 93,9±2,45% (p<0,001) від вихідного рівня. У гіпертензивних щурів з оклюзією загальної сонної артерії кровонаповнення в інтактній півкулі збільшується на 84% (p<0,005), в ішемізованій – на 31,7% (p<0,02).

Отримані дані підтверджують більшу чутливість судин до дилатації під впливом натрію нітропрусиду у гіпертензивних щурів, що збігається з даними літератури (Katzung B., 2007). Діастолічний тиск наповнення  лівого передсердя у гіпертензивних щурів стійко знижується при застосуванні ніпруцелу протягом 45 хвилин на 18,8% (р<0,05), наніпрусу - на 23,6% (р<0,05), ЧСС має тенденцію до прискорення при обох шляхах введення натрію нітропрусиду на фоні максимального гіпотензивного ефекту препарату.

Рис. 1.  Динаміка АТ сер. під впливом аплікаційних препаратів у гіпертензивних  щурів

     При  буккальному застосуванні ніпруцелу встановлені позитивні метаболічні зміни у порівнянні з плацебо: під впливом препарату гальмується приріст активності ВВ-КФК на 18 % (р<0,05), ЛДГ– на 21,3% (р<0,05), лактату – на 35,2% (р<0,05) на тлі приросту вмісту пірувату на 34,4%. Редукція вмісту АТФ зменшилась на 14,3% (р<0,05).

     При дослідженні впливу ніпруцелу на моделі кардіального кризу легеневий коефіцієнт у інтактних щурів без набряку легень, що були забиті методом повітряної емболії, становив 0,750±0,03, у контрольних щурів після набряку легень – 0,161, тоді як у піддослідних тварин, які отримували аплікації  ніпруцелу – 0,413, що свідчило про суттєве зменшення набряку легеневої тканини (р<0,005).

    Результати досліджень фармакодинаміки ніпруцелу дали можливість стверджувати, що препарат проявляє церебропротективну дію шляхом збільшення мозкової перфузії та поліпшення показників енергетичного обміну в мозку, що свідчить про перспективність препарату для корекції високого АТ у хворих на АГ з церебральними ГК без загрози погіршення мозкової перфузії, яка властива таблеткам клофеліну і ніфедипіну короткої дії  (Дзяк Г.В. с соавт., 2009; Ardigo S., 2008).

     При дослідженні фармакодинаміки гель-німодипіну встановлено, що у гіпертензивних щурів гель проявляє достовірну гіпотензивну дію з 10 хв., яка  сягає максимуму на 40 хв. і триває 240 хв. (див. рис.1). Гель–німодипін підвищує кровонаповнення головного мозку в іпсілатеральній ураженій півкулі без розвитку феномену “обкрадання”, проявляє високу церебропротективну дію при експериментальному ГК за рахунок збільшення мозкового кровообігу, поліпшення показників енергетичного обміну нервової тканини, зменшення напруженості оксидативного стресу. Діастолічний тиск у лівому  передсерді знижується при внутрішньовенній інфузії німотопу на 49% від вихідного рівня (р<0,01), при буккальному застосуванні німодипіну тиск наповнення лівого передсердя знижується дещо менше, редукція його максимальна на 60 хв. після аплікації і досягає 26,6% від вихідного рівня (р<0,02).

     Трансмукозне введення німодипіну значно зменшує пригнічення аеробного гліколізу за рахунок економізації процесів анаеробного гліколізу (табл.1). Так, менш виражено гальмується пентозо-фосфатний шунт, про що свідчить зменшення активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази. Під впливом гелю зменшується приріст активності ВВ-КФК на 24,15% (р<0,05), ЛДГ– на 31,8% (р<0,01) і гексокінази – на 37,7% (р<0,02), збільшується вміст АТФ на 50,2 % (р<0,001), глікогену – на 24% (р<0,05),  пірувату – на 47,4% (р<0,01) на тлі редукції лактату на 35,5%, (р<0,01) по відношенню до щурів серії плацебо.

    Біохімічна адаптація мозкової тканини до умов гіпертензивного пошкодження  під впливом гель-німодипіну підтверджується зменшенням морфологічних ознак ураження мозку піддослідних щурів. У тварин, які одержували гель, відзначені менші ультраструктурні зміни в тканинах головного мозку за рахунок зменшення периваскулярного набряку, кращого кровонаповнення судин, відсутності початкових геморагій, скупчення крові під м’якою мозковою оболонкою і вогнищ плазматичного просякання. Поряд з деструктивно зміненими органелами з’являлися органели з ознаками компенсаторно-пристосувальних реакцій: зареєстровано збільшення мітохондрій з множинними інвагінаціями оболонки і розрідженим матриксом, проліферуючі канальці гранулярної та гладенької ендоплазматичної сітки, збільшення кількості лізосом та мультивезикулярних тілець. Дифузна гіперплазія гліоцитів відмічена тільки у 5 з 12 особин, тоді як у тварин серії плацебо зафіксована у всіх тварин серії.

     При вивченні експериментальної фармакодинаміки  еналаректу встановлено, що гіпотензивна відповідь на ректальну аплікацію препарату у гіпертензивних щурів починається з 30 хв., досягає максимуму на 120 хв., поступово підвищуючись до вихідного рівня  до 340 хв. (див. рис.1). Гіпотензивна реакція повільна, без зайвих коливань, що відповідає заявленим вимогам щодо аплікаційної лікарської форми еналаприлу. Після введення еналаректу гіпертензивним щурам з однобічним ішемічним ураженням півкулі мозку  кровонаповнення інтактної півкулі мозку збільшилось на 15%  і на 19% – в ураженій півкулі (р<0,05).

     На моделі  кардіального ГК встановлена кардіопротективна дія еналаректу. Так, легеневий коефіцієнт у щурів серії плацебо становить 0,148±0,011, у піддослідних тварин – 0,4350±0,015 (р<0,001). Вміст некротичних ділянок лівого шлуночка зменшується більш ніж вдвічі на тлі подвійного збільшення вмісту артеріол у порівнянні з контрольними тваринами, що свідчить про покращення кровопостачання міокарда. Лейкоцитарні інфільтрати практично не зустрічаються, мукоїдний набряк тканини легень значно знижується.