нейропротективное действие конденсированных производных [1,2,4]-триазинонов при моделировании острого нарушения мозгового кровообращения

Краткое содержание

Матеріали та методи досліджень. У наших дослідженнях використовувалися методи оцінки антиоксидантної активності (АОА) сполук in vitro, які відрізняються за механізмом ініціації вільнорадикальних процесів, субстратів окиснення та маркерних продуктів

Антиоксидантну активність сполук при неферментативному ініціюванні ВРО тестували за ступенем гальмування МДА суспензії яєчних ліпопротеїдів при додаванні солей двовалентного феруму [Г.I. Клебанов та ін., 1999, Ю.І. Губський та ін., 2002]. Антиоксидантну активність сполук за інгібуванням супероксидрадикалу оцінювали за ступенем гальмування аутоокиснення адреналіну в адренохром у лужному середовищі [Ю.І. Губський та ін., 2002]. Антиоксидантну активність сполук за інгібуванням нітроген монооксиду тестували за ступенем гальмування окиснення аскорбінової кислоти при 265 нм. Індукцію нітроген монооксиду здійснювали опроміненням водних розчинів натрій нітропрусиду (10 мМ) та аскорбінової кислоти (40 мМ) джерелом світла потужністю 300 Вт з довжиною хвилі 425 нм [Ю.І. Губський та ін., 2002].

Антиоксидантну активність сполук за інгібуванням окисної модифікації білків (ОМБ), викликаної реактивом Фентона, оцінювали за ступенем гальмування утворення 2,4-динітрофенілгідразонів – альдегідних та карбоксильних груп [B. Halliwell, 1999].

Вивчення антиоксидантної активності сполук в умовах «нітрозуючого стресу» оцінювали за ступенем гальмування утворення 2,4-динітрофенілгідразонів – альдегідних та карбоксильних груп та за підвищенням активності СОД в супернатанті головного мозку білих щурів. Для моделювання нітрозуючого стресу використовували динітрозольний комплекс ферум(ІІ)-цистеїну (DNIC) [А.Ф. Ванін, 1998].

Про ступінь антигіпоксичної активності робили висновки на основі подовження часу до першого апное у тварин, яких поміщали до герметичного контейнеру [К.П. Іванов, 1988; Є.А. Ільїн, 1966]. Про наявність антиамнестичної активності свідчило збереження навички в тесті умовної реакції пасивного уникнення (УРПУ) при введенні атропіну (40 мг/кг внутрішньоочеревинно) [Я. Буреш, О. Бурешова, 1991, М.Я. Головенко, 2002].

Експериментальна частина виконана на 770 статевозрілих білих нелінійних щурах обох статей, масою 200-250 г, 60 монгольських піщанках (гербілах) масою 45-60 г та 365 білих безпородних мишах масою 18-20 г. Тварини отримані з віварію ЧП «Біомодельсервіс». Тварини знаходилися на стандартному раціоні харчування, в умовах природної зміни дня і ночі. Усі експериментальні процедури здійснювали відповідно до Методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України [О.В. Стефанов, 2001], вимог Європейської конвенції із захисту хребетних тварин (Страсбург, 1986) та Статуту Української асоціації з біоетики та норм GLP (1992). Евтаназію тварин проводили шляхом декапітації під наркозом (тіопентал-натрій, 40 мг/кг).

Оскільки метою нашої роботи було дослідження нейропротективної активності синтезованих сполук, то необхідно було використовувати експериментальні моделі, адекватні клінічним проявам інсульту. Таким вимогам відповідає модель необоротної однобічної (гербіли) та білатеральної (білі щури) оклюзії загальних сонних артерій [С.Р. McGrow, 1977, О.В. Стефанов, 2002]. Внутрішньомозковий крововилив (ВК) моделювали введенням аутокрові в область внутрішньої капсули та стріопалідарних ядер [S. Takizawa, 1991, J.C. Grotta, 2007]. Двосторонній фокальний ішемічний осередок в лобовій частині кори головного мозку щурів створювали методом фотохімічної ішемії [B.D. Watson et al., 1985]. Ця методика заснована на принципі фотохімічної стимуляції утворення тромбів у судинах мозку щурів при взаємодії світлового променя з попередньо введеним до кровоносного русла флюоресцентним барвником – бенгальським рожевим.

Усі досліджувані речовини вводили тваринам у вигляді суспензії з Твіном-80 внутрішньошлунково один раз на добу, починаючи з виходу щурів із наркозу протягом 4 діб (гострий період ішемічного та геморагічного інсульту) та 18 діб (відновлювальний період). Досліджувалося  похідне  [1,2,4]-триазинонів – бензиловий естер 2-(3,4-дигідро-3-оксо-2Н-[1,2,4]-триазино[4,3-c]хіназолін-4-іл)оцтової кислоти (КО-17) – у дозі 10 мг/кг. Препарати порівняння вводили в дозах: пірацетам – 500 мг/кг, тіотриазолін – 50 мг/кг, емоксипін – 100 мг/кг.

У тварин з гострим порушенням мозкового кровообігу оцінювали реакції орієнтовно-дослідницької поведінки в тесті «відкрите поле». У щурів упродовж 3 хвилин реєстрували горизонтальну (число квадратів, які перетинала тварина), вертикальну (число вертикальних рухів) та дослідницьку (число заглядань у «нірки») активність [Я. Буреш, О. Бурешова, 1991].

Когнітивний дефіцит експериментальних тварин оцінювали за їх здатністю до навчання та запам’ятовування аверсивного стимулу в тесті УРПУ [Я. Буреш, О. Бурешова, 1991], який проводили після закінчення спостереження у відновлювальний період порушення мозкового кровообігу.

Вираженість неврологічного дефіциту визначали за шкалою McGrow [С.Р. McGrow, 1977] протягом усього часу спостереження. Тяжкість стану визначали за сумою відповідних балів при щоденному тестуванні.

Для оцінки ступеня ішемічного пошкодження тканин мозку та ефективності фармакологічної корекції проводили біохімічні дослідження тканин головного мозку. Головний мозок гомогенізували в сольовому ізотонічному розчині (0,15 М KCl) при охолодженні (до 4 °С) за допомогою скляного гомогенізатора у співвідношенні 1 : 40. Після відділення ядер та незруйнованих клітин (1000g) методом диференційного центрифугування (15000g) виділялася цитозольна фракція [М.І. Прохорова, 1982]. Для оцінки інтенсивності ВРО в тканинах головного мозку визначали ступінь окислювальної модифікації білків (ОМБ) [В. Halliwell, 1999] та рівень малонового диальдегіду (МДА) [Л.І. Андрєєва, 1988].

Стан антиоксидантної системи визначали за показниками активності супероксиддисмутази (СОД) [С. Чеварі, 1988], каталази [М.А. Королюк, 1988] та ГПР у тканинах мозку [М.І. Прохорова, 1982].

Також вивчали рівень нітритів у головному мозку [М.В. Горбунов, 1995] та активність NO-синтази [В.П. Реутов, 1999, Ю.М. Колесник, 2005, М. Feelisch et al., 2008].

Процеси вуглеводно-енергетичного обміну та окислення в циклі Кребса в головному мозку оцінювали за рівнем аденілових нуклеотидів (АТФ, АДФ, АМФ) [Н.Б. Захарова, 1980], лактату, малату [М.І. Прохорова, 1982], активності сукцинатдегідрогенази (СДГ) та цитохром-С-оксидази (ЦХО) [В.С. Асатіані, 1969].

Стан ГАМК-ергічної системи головного мозку вивчали за концентрацією гліцину, ГАМК, глутамату та активністю глутаматдекарбоксилази (ГДК) [В.А. Розанов, 1980, М.І. Прохорова, 1982].

Здатність досліджуваних сполук підвищувати виживаність нейронів в умовах глутаматної ексайтотоксичності досліджували in vitro на суспензії нейрональних клітин [М.І. Прохорова, 1982], до якої додавали глутамінову кислоту (100 мкмоль) або N-метил-D-аспартат (200 мкмоль) [О.О. Болдирев, 2000]. Гостру токсичність визначали методом Кербера в модификації А.О. Лойта [А.О. Лойт, М.Ф. Савченков, 1996].

Для проведення морфометричних та гістоімунохімічних досліджень тканини головного мозку експериментальних тварин поміщали на 24 години у фіксатор Буена та після стандартної гістологічної проводки тканину вміщали у парафін [Е. Пірс, 1962].

Для вивчення морфометрії нейронів зрізи фарбували для визначення нуклеїнових кислот галоціанін-хромовими галунами за Ейнарсоном [Е. Пірс, 1962]. Для виявлення експресії c-fos у сенсомоторній зоні фронтальної кори використовували імуногістохімічний метод непрямої імунофлюоресценції [A.P. Johnstone, 1997]. Зображення Fos-імунопозитивних нейронів сенсомоторної зони, які отримували на мікроскопі, за допомогою високочутливої відеокамери COHU-4922 (COCHU Inc., США) вводили до комп’ютерної програмно-апаратної системи цифрового аналізу зображення VIDAS [Y.M. Kolesnik et al., 2002]. Статистичну обробку даних проводили з використанням параметричного критерію t-Стьюдента, однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA), непараметричного U-критерію у рамках програми MS Excell. Вірогідними вважали відмінності з рівнем значення більше 95% [Л. Закс, 1976].