ПОШУК ЗАСОБІВ ПРОФІЛАКТИКИ ІШЕМІЇ ГОЛОВНОГО МОЗКУ СЕРЕД АНТИОКСИДАНТІВ В РЯДУ ПОХІДНИХ ТІАЗОЛІДИНУ
Тип:
Автореферат
Краткое содержание:
Матеріали та методи дослідження. Досліди виконані на 920 статевозрілих безпородних щурах обох статей масою 160-220 г. В експерименті використовувалися тварини після проходження карантину в умовах віварію ЛугДМУ протягом 14 діб.
Дослідження проводили в лабораторії кафедри фармакології ЛугДМУ сертифікованої Державним фармакологічним центром (ДФЦ) МОЗ України (посвідчення № 41 від 30.05.2002р. та № 07 від 29.09.2005р.) в рамках норм біоетики (наказ ректора ЛугДМУ № 3 від 10.11.2005р.) згідно з методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Київ, 2001).
Експериментальною моделлю гострої ішемії головного мозку служив патологічний процес, який розвивається у тварин з необоротньою одномоментною двобічною оклюзією загальних сонних артерій до місця її біфуркації на зовнішню та внутрішню гілки. Оперативне втручання проводили під натрій-тіопенталовим (70 мг/кг) наркозом.
Віртуальний скринінг проводили серед оригінальних сполук похідних тіазолідину* на основі комп'ютерної програми PASS C&T (PredictionofActivitySpectraforSubstances: Complex&Training) та Log/ACDLabs для дослідження антиоксидантної, антирадикальної та протиішемічної активностей.
Вивчення антиоксидантної активності (АОА) сполук проводили на двох моделях ініціювання ВРО - при неферментативному ініціюванні ВРО та по інактивації супероксидрадикалу.
Неферментативне ініціювання ВРО моделювали в суспензії яєчних ліпопротеїнів шляхом додавання FeSO4. Інтенсивність протікання процесів ВРО в модельній системі оцінювали за концентрацією продуктів ПОЛ, що реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реактанти) з урахуванням коефіцієнта молярної екстинції (Ю.І. Губський і співав., 2002).
Індукцію супероксидрадикалу проводили шляхом аутоокиснення адреналіну в адренохром у лужному середовищі. АОА оцінювали за ступенем гальмування утворення адренохрому (HaraP. Misra, 1972). Досліджувані речовини додавали в систему до ініціювання ВРО в кількості кратній їх молекулярній масі.
В дослідах invitro в якості препаратів порівняння застосовували класичні антиоксиданти, а саме: для водорозчинних сполук - кислоту аскорбінову, жиророзчинних - токоферолу ацетат (В.А.Барабой, Д.А.Сутковой, 1997).
В серії фармакологічного скринінгу потенційних церебропротекторів сполуки, що вивчалися, вводили з профілактичною метою внутрішньоочеревинно одноразово за 30 хвилин до початку моделювання цереброваскулярної патології в дозі 100 мг/кг. В якості референтних препаратів використовували кавінтон („Гедеон Ріхтер”, Угорщина) в дозі 5 мг/кг (А.А. Спасов и соавт., 2003) та пірацетам („Дарниця”, Україна) в дозі 250 мг/кг (О.Ю. Бибик, 2002) за 30 хвилин до початку оклюзії сонних артерій. Ефективність препаратів оцінювали в динаміці за виживанням тварин та термінами їх загибелі, а також за клінічними симптомами перебігу гострої ішемії головного мозку в щурів.
В окремій серії токсикометричних досліджень похідного тіазолідину (Les-13), як найефективнішого церебропротектора за результатами попередніх комплексних скринінгових досліджень, вивчали гостру токсичність згідно з методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Київ, 2001) з застосуванням пробіт-аналізу з подальшою лінеаризацією експериментальних даних методом найменших квадратів (В.Б. Прозоровский, 1962).
При розробці дозового режиму Les-13 сполуку вводили внутрішньоочеревинно в дозах: 50, 100 та 150 мг/кг в різний час відносно моменту двобічного перетину загальних каротидних судин. Ефективність субстітуенту оцінювали за виживанням щурів (через 9, 22 та 36 годин з моменту перетину загальних сонних артерій). Математичну залежність протиішемічного ефекту Les-13 від доз визначали методом двофакторного експерименту (Е.Е. Рафаелес и соавт., 1971) за допомогою спеціально розробленої на кафедрі фармакології ЛугДМУ програми для Pentium 200 MMX в середовищі TurboPascalV. 7.0., а аналіз функції та розрахунок оптимальних доз проводили графічним способом з використанням стандартної програми MachEngineV 2.001 (Д.С. Кравець, 1999)*.
В подальшому щурам дослідної групи Les-13 вводили одноразово внутрішньоочеревинно у вигляді 1% водного розчину в дозі 91,8 мг/кг за 138 хвилин до початку моделювання ішемічного інсульту головного мозку. Всі досліди проводили в динаміці: через 1, 6 та 24 години після двобічного перетину загальних сонних артерій. Біосубстратами для проведення досліджень слугували сироватка крові та кора головного мозку.
Антирадикальну активність Les-13 на моделі гострої цереброваскулярної недостатності вивчали методом біохемілюмінісценції (БХЛ). Для оцінки здатності впливу сполуки на динаміку перекисних процесів у дослідах invitro в якості субстрата використовували стерильний 10% розчин альбуміну. БХЛ індукували перекисом водню (В.Д. Лук’янчук та співав., 1997). Кінетику вільнорадикальних реакцій реєстрували на люмінометрі «EMILLITE-1105» австро-німецько-російського виробництва фірми „Біо-Хім-Мак”. Кінетику надслабкого світіння в дослідах invitro і invivo оцінювали за амплітудою швидкого спалаху (I1), амплітудою повільного спалаху (I2), константою швидкості змін інтенсивності світіння (К1), часом індукції повільного спалаху (t), а також загальною світлосумою реакції (S).
Серед продуктів ліпопереокиснення досліджували концентрацію початкових – дієнових кон’югатів (ДК) (И.Д. Стальная, 1977) та ТБК-реактантів (И.Д. Стальная, Г.Г. Гаршвили, 1977).
При вивченні стану основних компонентів антиоксидантної системи захисту організму визначали активність супероксиддисмутази (СОД) (В.А. Костюк та співав., 1990), а також рівень глутатіону відновленого (J. Sedluck, H.Lindsay, etal., 1968) та сульфгідрильних груп (G.L. Ellman, 1959). Забезпеченість організму ендогенними антиоксидантами в умовах експерименту оцінювали за станом перекисної резистентності еритроцитів (О.Г. Архипова, 1988).
_________
*) Щиро вдячні доц. Д.С. Кравцю за надання консультативно-методичної допомоги
Визначення рівня аденілових нуклеотидів в еритроцитах проводили методом тонкошарової хроматографії на пластинах фірми „Merk”, Німеччина (Н.Б. Захарова, В.И. Рубин, 1980). На підставі отриманих даних розраховували показники, які характеризують стан енергетичного гомеостазу у вивчаємих умовах експерименту: енергетичний заряд (ЕЗ), енергетичний потенціал (ЕП), індекс фосфорилювання (ІФ) та порівняльний коефіцієнт (Кпор).
Активність ферментів енергетичного обміну в крові оцінювали за допомогою біохімічних наборів „Філісіт-Діагностика” для лактатдегідрогенази (Україна) та „PLIVA-Lachema”- креатинкінази (Чеська республіка).
Вплив церебропротектора на зв’язувальну здатність сироваткових білків в умовах гострої ішемії головного мозку визначали методом рівноважного діалізу (А.И. Луйк, В.Д. Лукьянчук, 1984). Кількісні параметри, які характеризують процес зворотнього зв’язування – константу асоціації (Кас.) та число місць фіксації (N), розраховували за розробленою на кафедрі фармакології ЛугДМУ комп’ютерною програмою (В.Д. Лук’янчук та співавт, 2004).
Патоморфологічне дослідження кори головного мозку проводили з використанням загальновідомих методичних прийомів (Р. Ліллі, 1969).
Отримані дані оброблені статистично за допомогою критерію tСт’юдента (Ю.І. Іванов, 1990), а також непараметричного критерію статистики – точного методу Фішера для чотирипільної таблиці (Е.В. Гублер, 1978).