ПОРУШЕННЯ ІМУНІТЕТУ, ОКСИДАНТНОЇ ТА АНТИОКСИДАНТНОЇ СИСТЕМ ПРИ ХРОНІЧНОМУ ГЕПАТИТІ С (КЛІНІКО-ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ)

Краткое содержание

Матеріал і методи дослідження. У гастроентерологічному відділені ДОКТМО „Обласна клінічна лікарня ім. М.Калініна” та інфекційному відділенні КЛПУ „Міська лікарня №1” м. Донецька провели поглиблене обстеження 105 хворих на ХВГС і 48 практично здорових осіб (контрольна група). В основну групу ввійшли хворі у віці від 16 до 69 років, середній вік (39,43±1,38) років відповідно до контролю (38,47±1,51) років не відрізнявся (St=0,41, p=0,677). Серед хворих був 71 пацієнт чоловічої статі (67,61±4,56)% і 34 – жіночої (32,38±4,56)%, в контролі 33 – чоловічої (68,75±6,69)% і 15 – жіночої (31,25±6,69)%, що не різнило групи за статтю (c²=0,0001 p=0,951; c²=0,01 p=0,920 відповідно).  

Методи обстеження хворих на ХВГС включали в себе клінічні, біохімічні, імунологічні, вірусологічні, сонографічні та морфологічні (морфо-функціональний стан печінки). Ступінь активності гепатиту класифікували за тяжкістю синдрому цитолізу і запальних змін (інфільтрації) з боку печінкового біоптату, або за співвідношенням АЛТ\АСТ (Губергриц Н.Б., 2000). Встановлювали гепатит С за наявністю анті-HCV, анті-HCV IgM методом ІФА і РНК HCV методом ПЦР. Було використано класифікацію гепатитів Міжнародної робочої групи Всесвітнього конгресу гастроентерологів у Лос-Анджелесі (1994) (WCOG – 1994) (Голованова Е.С.,2003). Відбирали хворих, які мінімум за три тижні до надходження до стаціонару не отримували лікування, а імунологічні і біохімічні дослідження проводили до початку лікування. Відповідно до клінічних, сонографічних, морфологічних методів дослідження встановлено, що зі 105 хворих у 56 обстежених був цироз печінки (53,33±4,86)%, мінімальна активність перебігу захворювання спостерігалась у 42 хворих (40,00±4,78)%, помірна активність – у 52 (49,52±4,87)%, висока активність – у 11 хворих (10,47±2,98)%, порушення обміну білірубіну відмічали у 60 хворих – (57,14±4,82)%.

Загальний клінічний аналіз крові виконували на цитологічному аналізаторі COBAS EMIRA (фірми La ROCHE, Австрія) з визначенням кількості еритроцитів, гемоглобіну, кольорового показника, кількості лейкоцитів, лімфоцитів, мононуклеарів, нейтрофілів і швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ). У хворих на ХВГС визначали поверхневі антигени лімфоцитів типу СD3+, СD4+, СD8+, CD16+, СD22+ методом непрямої імунофлюоресценції в модифікації (Бебешко В.Г. і співавт., 1993). Імуноглобуліни класів А, М, G у сироватці крові визначали за модифікованою методикою G.Mancini (1965) (Polowna S., 1976). Відомо багато способів визначення розчинних імунних комплексів. Найбільше поширення отримав метод селективної преципітації у середовищі, яке містить поліетиленгліколь (ПЕГ) 6 000 (Digeon M., 1977). Для преципітації використовували 3,50% ПЕГ (Барановский П.В., 1982; Белозеров Е.С., 1982; Гриневич Ю.А.,1981) з подальшою нефелометрією на ФЕК-56 та переведенням одиниць екстинції у вагові по калібрувальній кривій, яка побудована відповідно агрегованому людському імуноглобуліну з визначенням білку у преципітатах за Лоурі  (Гриневич Ю.А.,1981).

Титри аутоантитіл визначали у реакції пасивної гемаглютинації (РПГА) (Bing D.H. at all.,1967). Реакцію гальмування міграції макрофагів РГММ у тварин виконували в агарі. Нестимульовані макрофаги одержували шляхом промивання черевної порожнини тварин (через голку) розчином Хенксу з гепарином (5 ОД/мл). Кількість клітин підраховували у камері Горяєва (Учитель И.Я., 1978). Постановку спонтанного НСТ-тесту здійснювали за загальноприйнятою методикою (Виксман М.Е., 1979). Фагоцитарну активність нейтрофілів периферичної крові людей і перитонеальних макрофагів у тварин визначали по відношенню до тест-культури стафілококу штам 209 (Меньшиков В.В.,1987).

Біохімічні показники в обстежених хворих визначали за допомогою біохімічного аналізатора COBAS EMIRA (фірми La ROCHE, Австрія) – білірубін загальний, прямий білірубін, непрямий білірубін, АЛТ, АСТ, загальний білок, сечова кислота (СК). Визначали також активність ксантиноксидазии у людей і тварин (КО) (Карпищенко А.И., 2002). Визначали у крові людей і тварин продукти перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) – дієнові кон’югати (ДК) ненасичених вищих жирних кислот (Карпищенко А.И. 2002; Гаврилов В.П., Мишко­рудная М.И. 1983). Малоновий діальдегід (МДА) визначали у крові людей і тварин (Стальная И.Д.,1977). Вітамін Е (віт. Е) визначали в сироватці крові людей (Киселевич Р.Ш., 1972). Каталазу (К) визначали у людей і тварин (Королюк М.А.,1988). Активність супероксиддисмутази (СОД) визначали у людей (Макаревич О.П., 1983). Визначали антиокислювальну активність (АОА) плазми крові хворих (Клебанов Г.И., 1988).

Автором було розроблено спосіб моделювання хронічного гепатиту по типу гепатиту С, в якому забезпечується розвиток морфологічних змін хронічного гепатиту по типу С у всіх без винятку тварин, що брали участь в експерименті. Дослідження проведено на 40 білих безпородних щурах з середньою вагою 180,0 г. Їх розподілено на 2 групи. 1 групу становили інтактні тварини (20 щурів). 2 група (20 тварин) з моделюванням хронічного гепатиту по типу гепатиту С по повній схемі (під шкіру задньої лапки щурів вводили чотирьоххлористий вуглець (СCl₄) у дозі 0,25 мл 50% розчину в олії чотирьохразово через кожні 5 днів, а по закінченні в корінь хвоста щурів проводили трьохразове введення повного ад’юванта Фрейнда з гомогенатом печінки, в кількості 0,5, 0, 25, 0,25 мл, дворазове введення в проміжках азатіоприну у дозі 50 мг/кг). Через 10 днів після останнього введення повного ад’юванта Фрейнда з  гомогенатом печінки тварин забивали під ефірним наркозом.

Для оцінки ефективності лікування експериментального хронічного гепатиту по типу С в 40 дослідних тварин використовували два підходи, по-перше, імуномодулятор циклоферон уводили внутрішньом’язово у дозі 0,2 мл 12,5% розчину на тварину протягом 20 днів п’ять разів кожній з 20 тварин (через місяць після початку лікування досліджували імунологічні та біохімічні показники), а також, по-друге, 20 тваринам вводили гомологічні клітини печінки у дозі 0,5 мл (близько 0,5 млн. клітин гомологічної печінки, отриманої від щурят) у дві точки стінки живота внутрішньом’язово, а через місяць проводили імунологічні та біохімічні дослідження.

Аналіз результатів дослідження побудовано на принципах доказової медицини (Флетчер Р. та ін., 1999). Результати досліджень обчислювали за допомогою параметричних і непараметричних методів статистики, а також використовували кореляційний та регресійний аналіз, з оцінкою середнього значення (), їхньої помилки – (S), коефіцієнту кореляції (r), критерія Стьюдента (St), медіанного (Mk), Уілкоксона (kW), Манна-Уітні (MW), Хі-квадрата (χ²) і Крускала-Уолліса (kKW), достовірності розходжень статистичних показників (р) на комп’ютері Toshiba (Satellite M70-160) за допомогою ліцензійних пакетів “Statistica 5.5” (Stat Soft Rus) і „MedStat” („Информатика и компьютеры”, Москва і НВП „Альфа”, Донецьк) (Боровиков В.П., Боровиков И.П., 1998; Лях Ю.Е. та ін., 2000, 2006). 

Результати власних досліджень. У хворих на ХВГС середня кількість лейкоцитів була статистично значно зменшеною (5,82±0,21)Г/л (див.табл.). В порівнянні з контролем у них вірогідно реєструвалося збільшення відносного вмісту паличкоядерних форм нейтрофілів (6,53±0,46)%, а також зменшення кількості сегментоядерних нейтрофілів до (48,74±1,37)%. Відмічалося статистично значуще збільшення відносного вмісту моноцитів (7,71±0,34)%. Абсолютна кількість еозинофілів в хворих на ХВГС була значно менша (0,115±0,011) Г/л.

У хворих на ХВГС визначено зменшення відносного й абсолютного вмісту Т-лімфоцитів CD3+ (51,30±1,35)% і (1,069±0,069)Г/л. У них мало місце зниження відносної і абсолютної кількості Т-хелперів CD4+ до (31,04±0,96)% і (0,647±0,043)Г/л. Встановлено статистично значуще зменшення у хворих відносної і абсолютної кількості CD8+-клітин (20,21±0,51)% і (0,416±0,025)Г/л. Внаслідок значного зменшення кількості хелперів співвідношення CD4/CD8 вірогідно було меншим у групі хворих, становлячи (1,54±0,03). Експресія на природних кілерах CD16+-рецепторів також була значно зниженою і становила (14,91±0,42)% і (0,314±0,021)Г/л.

Таким чином, згідно з результатами дослідження Т-ланки імунітету було встановлено, що у хворих на ХВГС розвивається Т-клітинний імунодефіцит по гіпохелперному-гіпосупресорному типу зі зменшенням імунорегуляторного індексу.

Так, відносна та абсолютна кількість В-лімфоцитів була підвищена у хворих на ХВГС CD22+ до (23,42±0,51)%. Мала місце значна активація кількості та функціональної активності В-лімфоцитів. Підвищення функціональної активності виражалося в гіперімуноглобулінемії G, A і M ((14,81±0,23) г/л, (2,45±0,04) г/л і(1,44±0,03) г/л).