СТАН ІМУНИТЕТУ У ХВОРИХ НА МІКРОБНУ ЕКЗЕМУ З МІКОГЕННОЮ АЛЕРГІЄЮ

Краткое содержание

Матеріали та методи дослідження. Групування дослідів.

      З метою вирішення поставленої задачі – вивчення in vivo стану імунітету у осіб, які хворіють на мікробну екзему та впливу наявності в них мікогенної алергії, а також вивчення патогенезу алергічних захворювань. Під спостереженням знаходилося 46 пацієнтів віком від 20 до 70 років хворих на хронічну мікробну екзему, середньої ступені важкості в період загострення, які знаходились на лікуванні в Полтавському обласному клінічному шкірно – венерологічному диспансері та складали основну групу, відповідно, практично здорові особи складали групу порівняння. Вибірки пацієнтів були врівноважені за віком та статтю.

     Програма та результати досліджень схвалені комісією з етичних питань та біоетики Вищого державного навчального закладу України “Українська медична стоматологічна академія” та вважає, що наукові дослідження, проведені аспірантом Центральної науково-дослідної лабораторії ВДНЗУ “Українська медична стоматологічна академія” м.Полтава та Обласним клінічним шкірно – венерологічним диспансером м. Полтава відповідають морально – етичним нормам у відповідності до принципів Гельсінської декларації прав людини, Конвенції Ради Європи щодо права людини і біомедицини , відповідних законів України, етичного Кодексу лікаря України (Протокол №57 засідання Коміссії з етичних питань та біоетики від 19.02.2008р. у складі, затвердженому ректором ВДНЗУ “Українська медична стоматологічна академія” м.Полтава наказ № 06 від 17.01.2008р.).

     Діагноз мікробної екземи був встановлений на основі анамнестичних даних: травматизація, вплив екзогенних факторів (хімічні, біологічні агенти, бактеріальні алергени, фізичні фактори, медикаменти, харчові продукти, косметичні препарати), клінічних даних: асиметричний процес на шкірі гомілок, тилу кистей, волосистої частини голови; наявність різких, чітко виражених меж вогнища ураження, іноді з нерівним краєм рогового епітелію, який відшаровується по краю вогнища зі слабо вираженою тенденцією до дисемінації дерматозу; межі вогнищ нерідко вигнуті, на їх поверхні наявні скупчення зеленувато – жовтих, серозно – гнійних і кров`янистих корок, ерозії, результатах лабораторних методів обстеження.    

     Із дослідження виключалися хворі із важким перебігом мікробної екземи, а також пацієнти, які отримували кортикостероїдні препарати.

     Об`єктом дослідження була гепаринізована кров та сироватка крові. У донорів та пацієнтів згідно їхньої згоди та заключення комісії по біоетиці, забір крові проводили натщесерце за допомогою одноразових пластикових шприців із кубітальної вени. Забрану кров  поміщали в скляну пробірку з гепарином.

     Використовували суспензію лімфоцитів, яку отримували з периферійної крові за стандартною методикою (Клаус Д., 1990) шляхом центрифугування на градієнті густини фікол – верографіну (густина 1,077 г/мл) із наступним відмиванням у ФСБ та подальшим ресуспензуванням. Кількість клітин при підрахунку (Меньшиков В.В. и др.,1987) у камері Горяєва складала в середньому 2 × 10⁶ клітин в 1мл суспензії.  Фенотип лімфоцитів аналізували за допомогою визначення експресії маркерів на поверхні клітин методом проточної лазерної цитометрії, що дозволяє оцінити практично всі параметри функціонування імунокомпетентних клітин (Пинегин Б.В. и др., 2002). В основі визначення фенотипу імуноцитів є взаємодія моноклональних антитіл (МкАТ), зв`язаних з флюорисцентною міткою, з поверхневими антигенами лімфоцитів з наступним аналізом проб на проточному цитофлюориметрі (Савицкий В.П. и др., 2002). Визначали експресію молекул –CD (кластери диференціювання), а саме CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD16⁺, CD20⁺ на поверхні клітин для отримання  уяви про стан імунітету у осіб, які тривало хворіють на мікробну екзему. Для отримання чіткої уяви, додатково у хворих визначали рівень імуноглобулінів А, М, G в сироватці крові за стандартною методикою імуноферментного визначення імуноглобулінів, а також визначали фагоцитарну активність нейтрофілів, активність лізосомальних катіонних білків, кисень – активуючої здатності нейтрофілів за НСТ-тестом.

     З ціллю визначення наявності чи відсутності у вогнищі ураження у хворих  грибів Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Alte aria, Mucor, Candida був використаний метод якісного визначення ДНК у біологічних зразках методом полімеразної ланцюгової реакції. Матеріалом для аналізу був патологічний матеріал, зібраний з вогнища ураження методом соскобу.

     Для визначення рівню сенсибілізації організму людини до алергенів пліснявих грибів Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Alte aria, Mucor, Candida використовувалася стандартна методика для якісного визначення алерген-специфічних IgE-антитіл в сироватці людини.

     Методи досліджень.

      Рівень специфічного IgE в сироватці крові визначався за допомогою імуноферментного методу з використанням тест-систем, целюлозних дисків з нанесеними найбільш розповсюдженими алергенами грибів: Mucor racemosus, Alte aria tenuis, Candida albicans, Penicillium notatum, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus виробництва Dr. Fooke (Gremany), оптична густина досліджуваних зразків визначалася на імуноферментному аналізаторі “Stat fax 303 plus”, ( USA).

      Рівень специфічного IgG4 в сироватці крові визначався за допомогою імуноферментного методу з використанням моноклональних антитіл проти

IgG4 людини, мічених пероксидазою, виробництва ООО “Полигност” (Росія); целюлозних дисків з нанесеними алергенами виробництва Dr. Fooke (Germany), оптична густина досліджуваних зразків визначалася на імуноферментному аналізаторі “Stat fax 303 plus” (USA).

    Рівень імуноглобулінів А, М, G в сироватці крові за стандартною методикою імуноферментного визначення імуноглобулінів за допомогою тест-систем ООО “Хема-медика” (Россия).

      Для визначення фенотипу лімфоцитів периферійної крові в роботі нами були використані МкАТ (мишині IgG) до поверхневих антигенів -   CD, які мічені флюорисцеінізотіоціонатом (FITC) – CD3-FITC, CD4-FITC, CD8-FITC, CD16-FITC, CD20-FITC (“Epix XL-MCL”, Beckman Coulter, USA; Сорбент, Росія). Для ізотипічного контролю використовували мишині IgG, кон`югований FITC(CALTAG, USA). Метод заснований на використанні імунологічної реакції антиген – антитіло та високої специфічності антитіл у відношенні до клітинних антигенів.