Тугай Андрій Васильович. ВПЛИВ ХРОНІЧНОГО ОПРОМІНЕННЯ НА ҐРУНТОВІ МІКРОМІЦЕТИ ЗОНИ ВІДЧУЖЕННЯ ЧОРНОБИЛЬСЬКОЇ АЕС : Тугай Андрей Васильевич. ВЛИЯНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ НА ПОЧВНЫЕ МИКРОМИЦЕТЫ ЗОНЫ ОТЧУЖЕНИЯ ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АЭС Tugay Andrey Vasilyevich. EFFECT OF CHRONIC EXPOSURE ON SOIL MICROMYCETES OF THE CHORNOBYL NPP ALIENATION ZONE

Краткое описание

Тугай Андрій Васильович. Назва дисертаційної роботи: "ВПЛИВ ХРОНІЧНОГО ОПРОМІНЕННЯ НА ҐРУНТОВІ МІКРОМІЦЕТИ ЗОНИ ВІДЧУЖЕННЯ ЧОРНОБИЛЬСЬКОЇ АЕС"

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
Тугай Андрій Васильович
УДК 582.28:614.876
ВПЛИВ ХРОНІЧНОГО ОПРОМІНЕННЯ НА ҐРУНТОВІ
МІКРОМІЦЕТИ ЗОНИ ВІДЧУЖЕННЯ ЧОРНОБИЛЬСЬКОЇ АЕС
03.00.01 − радіобіологія
Дисертація на здобуття
наукового ступеня кандидата біологічних наук
Науковий керівник
доктор біологічних наук, професор
Лукашов Дмитро Володимирович
Київ ─ 2016
2
З М І С Т
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
ВСТУП
РОЗДІЛ 1
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ.
ВІДДАЛЕНІ НАСЛІДКИ ВПЛИВУ ХРОНІЧНОГО ОПРОМІНЕННЯ
НА МІКРОМІЦЕТИ
1.1. Накопичення штучних радіонуклідів грибами
1.2. Деструкція «гарячих частинок» мікроміцетами
1.3. Вплив грибів на перехід радіонуклідів у системі
ґрунт – вищі рослини
1.4. Дія і діапазон малих доз опромінення для різних
представників біоти
1.5. Вплив та значення активних форм кисню у метаболізмі грибів
1.6. Ферментативна антиоксидантна система грибів
1.6.1. Види та роль супероксиддисмутаз грибів
1.6.2. Види та особливості дії каталаз та пероксидаз грибів
РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Oб’єкти дослідження
2.2. Методи культивування мікроміцетів
2.2.1. Культивування посівного матеріалу
2.2.2. Адаптована модельна система для отримання опромінених
генерацій мікроміцетів
2.2.3. Отримання опромінених генерацій досліджених
вихідних штамів
2.3. Вимірювання параметрів росту мікрoміцетів
2.4. Визначення активності ферментів антиоксидантного захисту
5
6
13
13
16
22
24
29
32
32
35
39
39
41
41
42
48
48
49
3
2.4.1. Отримання дезинтеграту для визначення активності
внутрішньоклітинних ферментів мікроміцетів
2.4.2. Визначення каталазної активності мікроміцетів
2.4.3. Визначення пероксидазної активності мікроміцетів
2.4.4. Визначення супероксиддисмутазної активності мікроміцетів
2.5. Дослідження взаємодії у системі мікроміцет - «гаряча частинка»
2.6. Статистична обробка результатів
РОЗДІЛ 3.
ВПЛИВ ХРОНІЧНОГО ОПРОМІНЕННЯ НА ВИЖИВАНІСТЬ ТА
ШВИДКІСТЬ РАДІАЛЬНОГО РОСТУ У ОПРОМІНЕНИХ
ГЕНЕРАЦІЯХ МІКРОМІЦЕТІВ
3.1. Виживаність мікроміцетів за дії хронічного опромінення
3.2. Швидкість радіального росту у пострадіаційних генераціях
мікроміцетів
3.2.1. Швидкість радіального росту у пострадіаційних генераціях
Cladosporium cladosporioides
3.2.2. Швидкість радіального росту у пострадіаційних генераціях
Paecilomyces lilacinus
3.2.3. Швидкість радіального росту у пострадіаційних генераціях
Aspergillus versicolor
3.2.4. Швидкість радіального росту у пострадіаційних генераціях
Hormoconis resinae
РОЗДІЛ 4
АКТИВНІСТЬ АНТИОКСИДАНТНИХ ФЕРМЕНТІВ
У ГЕНЕРАЦІЯХ ҐРУНТОВИХ МІКРОМІЦЕТІВ
4.1 Активність антиоксидантних ферментів у пострадіаційних
генераціяхCladosporium cladosporioides
4.2 Активність антиоксидантних ферментів у пострадіаційних
генераціяхPaecilomyces lilacinus
49
49
50
50
51
51
53
54
60
61
64
67
69
78
80
85
4
4.3 Активність антиоксидантних ферментів у пострадіаційних
генераціяхAspergillus versicolor
4.4 Активність антиоксидантних ферментів у пострадіаційних
генераціях Hormoconis resinae
РОЗДІЛ 5
ЗДАТНІСТЬ C. CLADOSPORIOIDES ПЕРЕВОДИТИ
РАДІОНУКЛІДИ, ЯКІ ВХОДЯТЬ ДО СКЛАДУ ПАЛИВНИХ
ЧАСТИНОК, У БІОЛОГІНО ДОСТУПНУ ФОРМУ
ОСНОВНІ УЗАГАЛЬНЕННЯ
ВИСНОВКИ
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ
91
96
107
118
127
129
5
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
АБТС ─ 2,2´ азино-біс (3 етилбензотіазолін-6-сульфонова кислота)
АСБ ─ абсолютно суха біомаса
АФК ─ активні форми кисню
ВБЕ ─ відносна біологічна ефективність випромінювання
ГА ─ голодний агар
ДІВ ─ дія іонізуючого випромінювання
ІЧ-спектри ─ інфрачервоні спектри
КУО ─ колоній утворюючі одиниці
Кr ─ швидкість радіального росту
ЛПЕ ─ лінійна передача енергії
СА ─ сусло-агар
СОД ─ супероксиддисмутаза
LiP ─ лігнін пероксидаза
МnР ─ марганець пероксидаза
6
ВСТУП
Актуальність роботи. Внаслідок Чорнобильської катастрофи у ґрунти
Зони відчуження ЧАЕС потрапило 31019 Бк [292] радіонуклідів, з яких і досі
дозоутворюючими залишаються 137Cs,
90Sr,
238-240Pu та 241Am, що перетворило
її на один із найбільших у світі полігонів для дослідження наслідків дії
хронічного опромінення на біоту.
Мікобіота є постійною і активною компонентою біогеоценозу та
виконує функції регулятора переміщування радіонуклідів, зокрема, у лісових
біогеоценозах [150]. Ґрунтові гриби це важлива ланка багатьох трофічних
ланцюгів, а їхня частка у мікробній біомасі ґрунту сягає 80% [4].
У попередніх дослідженнях, при вивченні механізмів адаптації ґрунтових
мікроміцетів до дії хронічного іонізуючого опромінення, у 80% мікроміцетів
було виявлено не відомі раніше радіоадаптивні властивості, які проявлялися
у спрямованому рості до джерел іонізуючого випромінювання та стимуляції
ростових процесів за дії великих (160 Гр/доб) доз опромінення, здатності
обростати паливні частинки чорнобильського походження, колонізувати
уранові частинки, переводити радіонукліди, що входять до їх складу, у
біологічно доступні форми [50; 126; 127; 129; 132; 136;189].
Для мікроміцетів характерна швидка зміна генерацій, що робить їх
зручною моделлю для вивчення ефектів хронічного опромінення у низці
генерацій, встановлення прямих та віддалених ефектів хронічного
опромінення у видів мікроміцетів різної екологічної спеціалізації, що часто
зустрічались у Зоні відчуження. Досліджені мікроміцети є продуцентами
цілої низки біологічно активних сполук, актуальним є встановлення умов
хронічного опромінення, за яких відбувається активізація їх росту, що може
бути використано при розроблені способів підвищення синтезу таких сполук.
Нині накопичено значний експериментальний матеріал з вивчення
ефектів хронічного опромінення у кількох генераціях рослинних об’єктів,
комах, ракоподібних, мишоподібних гризунів [42; 119; 137; 148; 267]. Проте,
практично відсутні дані щодо віддалених наслідків впливу хронічного
7
опромінення на мікроміцети, зокрема, що проявляли радіоадаптивні
властивості.
Встановлення реакцій-відповідей ґрунтових мікроміцетів, які зазнають
впливу хронічного опромінення упродовж багатьох генерацій, дає
можливість прогнозувати віддалені наслідки опромінення для мікроміцетів з
подальшим моделюванням видового та функціонального складу ґрунтових
біоценозів. Незважаючи на значний обсяг цих досліджень слід ще з’ясувати
наступні питання: які адаптаційні процеси сформувались у пострадіаційних
генерацій мікроміцетів та можливі механізми реалізації їх завдяки
особливостям функціонування ферментативного складника їхньої
антиоксидантної системи.
У зв’язку з накопиченням трансуранових елементів у ґрунті, зокрема, у
складі паливних частинок чорнобильського походження, з високою
радіотоксичністю і доволі тривалим періодом напіврозпаду багатьох
радіонуклідів, актуальним є вивчення шляхів регуляції потоків плутонію,
америцію та інших актиноїдів у трофічних ланцюгах. Великого значення
набуває виявлення внеску мікобіоти, особливо опромінених генерацій
мікроміцетів, у переведення радіонуклідів, що входять до складу паливних
частинок, зокрема, такого високотоксичного елемента як 241Am, який не має
природних стабільних аналогів, у біологічно доступну форму здатну
акумулюватися різними представниками біоти.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу
виконано на кафедрі екології та охорони навколишнього середовища ННЦ
«Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса
Шевченка у рамках науково-дослідної теми «Моніторинг, охорона та
корекція природних, трансформованих і модельних екосистем з метою
збереження біорізноманіття та підвищення їх стійкості до змін довкілля» (Д/Р
№ 0114U003470, 2014−2015 рр.). Частину досліджень виконано в Інституті
мікробіології та вірусології НАНУ у рамках науково-дослідної теми
«Дослідження фізіолого-біохімічного і генетичного біорізноманіття та
8
біосинтетичної здатності мікроорганізмів різних систематичних груп» (Д/Р
№ 0115U004130, 2011−2015 рр.). Моделювання радіоактивного опромінення
проводили на базі Інституту ядерних досліджень НАН України.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було охарактеризувати
дію хронічного опромінення на пострадіаційні генерації ґрунтових
мікроміцетів у модельних умовах, що імітують рівні забруднення ґрунту
Зони відчуження та оцінити здатність Cladosporium cladosporioides
переводити радіонукліди, які входять до складу паливних частинок з
високою активністю 241Am, у біологічно доступну форму та накопичувати їх
у біомасі мікроміцета.
Для досягнення мети досліджень було поставлено наступні завдання:
1. Встановити вплив хронічного іонізуючого опромінення на
виживаність ґрунтових мікроміцетів у модельних умовах для визначення
діапазону малих доз для них.
2. Дослідити швидкість радіального росту штамів Aspergillus versicolor,
Hormoconis resinae, C. cladosporioides та Paecilomyces lilacinus у трьох
пострадіаційних генерацій за дії малих доз.
3. Оцінити активність ферментів антиоксидантного захисту
(супероксиддисмутази, каталази та пероксидази) за дії малих доз у
досліджуваних штамів мікроміцетів.
4. Визначити здатність C. cladosporioides переводити радіонукліди, які
входять до складу паливних частинок з високою активністю 241Am у
біологічно доступну форму та накопичувати їх у біомасі мікроміцета.
Об’єкт дослідження: дія хронічного опромінення на ґрунтові
мікроміцети.
Предмет дослідження: виживаність опромінених штамів мікроміцетів,
ріст та активність ферментів антиоксидантного захисту за дії малих доз,
здатність переводити у біологічно доступну форму радіонукліди з паливних
«гарячих частинок» з високою активністю 241Am.
9
Методи досліджень: радіобіологічні (створення адаптованої модельної
установки для вивчення впливу хронічного опромінення та отримання
пострадіаційних генерацій; характеристика паливних частинок та визначення
здатності мікроміцетів переводити частину радіонуклідів, що входять до їх
складу, у біологічно доступні форми); мікробіологічні (культивування
мікроміцетів та дослідження їхніх властивостей); біохімічні (визначення
активності ферментів антиоксидантного захисту мікроміцетів), математичної
статистики (оброблення та аналізування отриманих результатів).
Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що іонізуюче
опромінення у діапазоні від 6 − 18 Гр обумовлює виникнення у
досліджуваних мікроміцетів ефектів, що властиві малим дозам. Уперше
отримано дані щодо характеру адаптації у трьох пострадіаційних генераціях
чотирьох видів мікроміцетів різних екологічних груп, що дає змогу
прогнозувати екологічні наслідки радіоактивного забруднення довкілля.
Уперше виявлено різні тенденції у характері змін у пострадіаційних
генерацій мікроміцетів на певних етапах онтогенезу. Показано, що
збільшення швидкості радіального росту більш виражене у пострадіаційних
генераціях контрольних штамів, в той час як більш виражені зміни у
функціонуванні антиоксидантної системи виявлено у пострадіаційних
генерацій штамів мікроміцетів з радіоадаптивними властивостями. Уперше
встановлено, що особливості функціонування антиоксидантних ферментів
пострадіаційних генерацій є видоспецифічними. Гормезисні ефекти
проявлялись у підвищенні пероксидазної та супероксиддисмутазної (СОД)
активності у C. cladosporioides, каталазної та пероксидазної – у H. resinae,
каталазної та СОД активності в A. versicolor і P. lilasinus. Уперше виявлено
часткове руйнування паливних «гарячих частинок» з високою активністю
241Am штамом C. сladosporioides 4061, що супроводжувалось перетворенням
частини радіонуклідів у біологічно доступні форми та накопиченням у
біомасі мікроміцета. Швидкість накопичення мікроміцетом 241Am
10
перевищувала швидкість накопичення 137Cs не зважаючи на те, що активність
останнього у складі «гарячих частинок» була у 7 – 10 разів вищою.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані, які у
сукупності виявили гормезисний ефект у пострадіаційних генераціях чотирьох
видів мікроміцетів є проявом віддалених наслідків дії хронічного опромінення
на мікобіоту, і можуть бути використані при формуванні довгострокових
прогнозів щодо трансформації ґрунтових мікробіоценозів Зони відчуження.
Виявлену активізацію росту пострадіаційних генерацій H. resinae (у кілька
разів) слід враховувати за оцінки ризиків, які можуть зростати, у зв’язку з тим,
що цей вид спричиняє біодеструкцію авіаційного пального та є причинним
агентом корозії. Встановлення умов, за яких виявлено активізацію росту та
збільшення активності ферментів антиоксидантного захисту у досліджених
мікроміцетів, що є продуцентами цілої низки біологічно активних сполук, може
бути використано при розроблені способів підвищення їх синтезу.
Практичне значення отриманих даних щодо здатності C. cladosporioides
акумулювати 241Am полягає у перспективі використання їх у біотехнологіях,
пов’язаних як з додатковою ремедіацією забруднених територій, так і для
деструкції радіоактивних матеріалів (відходів) і перетворення їх на форму,
що спрощує подальшу утилізацію. Отримані в роботі дані можуть бути
використані у радіоекології, мікології, екології та впроваджено в навчальний
процес у курсі лекцій з мікології, мікробіології та радіаційної мікробіології у
Відкритому міжнародному університеті розвитку людини «Україна».
Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою
автора. Здобувачем проведено експериментальні дослідження,
проаналізовано наукову літературу з цієї проблеми, узагальнено отримані
експериментальні дані, проведено порівняльний аналіз з опублікованими в
літературі даними. Автором особисто проведено опромінення вихідних
штамів мікроміцетів та отримано відповідні генерації, досліджено ростові та
фізіолого-біохімічні властивості генерацій мікроміцетів та взаємодію
мікроміцета з «гарячими частинками». Вибір теми дисертаційної роботи,
11
постановка мети, планування напрямків досліджень та узагальнення
результатів проведено спільно з науковим керівником. Усі дослідження зі
створення модельної установки для вивчення впливу хронічного
опромінення на пострадіаційні генерації мікроміцетів, характеристики
«гарячих частинок» виконано спільно з д.ф-м.н. В.О. Желтоножським та
Л.В. Садовниковим (Інститут ядерних досліджень НАН України), за що
автор висловлює щиру вдячність. Базою для проведення досліджень була
раніше створена у відділі фізіології та систематики мікроміцетів Інституту
мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України колекція
мікроміцетів, виділених з екотопів Зони відчуження ЧАЕС з різним рівнем
експозиційної дози та колекція штамів з вираженими радіоадаптивними
властивостями. Автор висловлює щиру вдячність керівнику та
співробітникам відділу за можливість проведення досліджень з
використанням цих унікальних колекцій та всебічну підтримку роботи.
Апробація результатів дисертації. Результати роботи було
представлено на: XII, ХХІІІ з’їздах товариства мікробіологів України
ім. С.М. Виноградського (Ужгород, 2009, Ялта, 2013); II, ІІІ
междисциплинарных микологических форумах России (Москва, 2010, 2012);
Х Українському біохімічному з’їзді (Одеса, 2010); Міжнародній конференції
«Радіобіологічні і радіоекологічні аспекти Чорнобильської катастрофи»
(Славутич, 2011); Міжнародній конференції «Двадцять п’ять років
Чорнобильської катастрофи. Безпека майбутнього» (Київ, 2011); XIII
Українському ботанічному з’їзді (Львів, 2011); V Міжнародній науковій
конференції «Молодь та поступ біології» (Львів, 2012); Междисциплинарной
научной конференции «Адаптационные стратегии живых систем», (Новый
Свет, Крым, 2012, 2013, 2014); Міжнародній науковій конференції
«Мікробіологія та імунологія – перспективи розвитку в XXI столітті» (Київ,
2014); XX, ХХІІ, ХХІІІ щорічніх конференціях Інституту ядерних
досліджень (Київ, 2013, 2015, 2016).
12
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 21 наукову працю,
у тому числі – 6 статей у фахових наукових виданнях (2 статі у наукових
міжнародних виданнях та 4 статі у виданнях України, що включені до
міжнародних наукометричних баз), 15 тез доповідей у матеріалах
вітчизняних та міжнародних наукових конференцій та з’їздів.
Структура та обсяг дисертації Дисертаційна робота складається зі
вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, 3 розділів
власних досліджень з обговоренням і узагальненням отриманих результатів,
висновків та списку використаних джерел, що включає 346 найменувань.
Дисертація викладена на 171 сторінках містить 45 рисунків і 4 таблиці.

Список литературы

ВИСНОВКИ
Роботу присвячено одному з актуальних питань радіобіології –
дослідженню віддалених наслідків впливу хронічного іонізуючого
опромінення на живі організми. Із застосуванням методів радіобіології,
мікробіології та біохімії, одержані нові результати щодо пострадіаційних
гормезисних ефектів у пострадіаційних генераціях чотирьох видів ґрунтових
мікроміцетів, що проявлялись у зміні швидкості радіального росту та
активності антиоксидантних ферментів. Виявлена здатність Cladosporium
cladosporioides до переведення частини радіонуклідів з паливних частинок з
високою активністю 241Am у біологічно доступні форми, які накопичувались
у біомасі мікроміцета.
1. За виживаністю мікроміцетів видів Aspergillus versicolor,
Hormoconis resinae, Cladosporium cladosporioides та Paecilomyces lilacinus
обґрунтовано розширення поняття малих доз хронічного опромінення для
ґрунтових грибів, що відповідає діапазону 6 – 18 Гр.
2. Уперше у трьох пострадіаційних генераціях штаму
C. cladosporioides з фонової території (за умов хронічного опромінення
кожної генерації у дозі 6 Гр/міс) виявлено гормезисний ефект, який
проявлявся у збільшенні швидкості радіального росту у 3 рази. При цьому
для генерацій штаму з території Зони відчуження ЧАЕС зміни у швидкості
радіального росту не характерні. Для пострадіаційних генерацій штамів
H. resinae незалежно від походження за умов хронічного опромінення
проявлялися гормезисні ефекти у вигляді 3,6−4 - разового збільшення
швидкості радіального росту.
3. Показано, що адаптивні властивості штаму C. cladosporioides з
території Зони відчуження ЧАЕС пов’язані зі зростанням СОД активності у 2
рази у трьох пострадіаційних генераціях та підвищенням у 4 рази
пероксидазної активності у всіх трьох генераціяx. У опромінених генерацій
128
штаму з фонових територій виявлено підвищення тільки пероксидазної
активності у другій пострадіаційній генерації.
4. Виявлено, що у H. resinae адаптація до хронічного опромінення
проявлялася у достовірному підвищенні каталазної та пероксидазної
активностей у всіх пострадіаційних генераціях штаму із Зони відчуження та у
першій і третій генераціях штаму з фонових територій.
5. Показано, що одним з пострадіаційних ефектів у опромінених
генераціях A. versicolor та P. lilacinus є підвищення СОД активності у 3,6 та
2,7 раза та у зростанні каталазної активності у 2,5 та 4,5 раза, відповідно.
6. Виявлено істотні різноспрямовані зміни пероксидазної активності
у пострадіаційних генерацій штамів A.versicolor: зменшення у 9 разів у
першій та третій генераціях обох штамів та підвищення у 9 та 2,5 раза у
другій генерації штаму з радіоактивно забрудненої та фонової територій,
відповідно.
7. Уперше встановлено, що C. cladosporioides спричиняв
переведення частини радіонуклідів у паливних «гарячих частинок» з високим
вмістом 241Am у біологічно доступні форми, які накопичувались у біомасі
мікроміцета. При цьому у біомасі не виявлено 90Sr, а швидкість накопичення
241Am перевищувала швидкість накопичення 137Cs, не зважаючи на те, що
активність останнього у складі «гарячих частинок» була у 7 – 10 разів
вищою.