Антирестрикционный белок ArdA, кодируемый трансмиссивной плазмидой IncI группы: мутационный анализ и изучение механизма действия Некрасов, Сергей Вячеславович

Краткое описание

Некрасов,СергейВячеславович.АнтирестрикционныйбелокArdA,кодируемыйтрансмиссивнойплазмидойIncIгруппы:мутационныйанализиизучениемеханизмадействия: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 2006. - 115 с.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
61:07-3/301 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО-НРОИЗВОДСТВЕИНЫЙ КОМИЛЕКС РОСЗДРАВА На правах рукописиНЕКРАСОВСЕРГЕЙВЯЧЕСЛАВОВИЧАНТИРЕСТРИКЦИОННЫЙБЕЛОКArdA,КОДИРУЕМЫЙТРАНСМИССИВНОЙНЛАЗМИДОИIncIГРУИНЫ: МУТАЦИОИИЫЙАНАЛИЗИ ИЗУЧЕИИЕМЕХАНИЗМАДЕЙСТВИЯСпециальность

стр. 7
работа посвященамутационномуанализуантирестрикционногобелкаArdA,кодируемоготрансмиссивнойплазмидойCollbР9группыIncI, иизучениюмехапизма егодействияна системы рестрикции-модификации 1-го типа. II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР II.1.Трансмиссивныеплазмиды.Плазмидыназываютсятрансмиссивнымиили коныогативными,

стр. 79
приводит к полной потереантирестрикционнойактивностибелкаArdA. Таким образом, при помощи тонкого делецнонногоанализамы ноказали, что областьбелкаArdA, существенная для егоантирестрикционнойактивности, локализуется исключительно в С-концевой частибелкаArdAс аминокислотного остатка А90 по R166

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Некрасов, Сергей Вячеславович
Список сокращений.
I. Введение.
И. Литературный обзор.
ПЛ. Трансмиссивные плазмиды.
II.2. Системы рестрикции-модификации ДНК у бактерий.
11.2.1. Три типа систем рестрикции-модификации.
11.2.2. Системы рестрикции-модификации 1-го типа.
11.2.2.1. Субъединица узнавания.
11.2.2.2. Субъединица модификации.
11.2.2.3. Модифицирующий фермент.
11.2.2.4. Субъединица рестрикции.
11.2.2.5. Комплекс рестрикции-модификации 1-го типа.
11.2.3. Системы бактерий, гидролизующие специфически модифицированную ДНК.
П.З. Системы антирестрикции.
II.3.1. Антирестрикционная активность бактериофагов.
П.З.2. Антирестрикционные системы, кодируемые трансмиссивными плазмидами.
Щ. Материалы и методы.
III.1. Штаммы E.coli, использованные в работе.
111.2. Плазмиды и бактериофаги, использованные в работе.
111.3. Среды для выращивания бактерий и фагов.
111.3.1. Жидкие среды.
111.3.2. Твердые среды.
Ш.4. Антибиотики, растворы солей и реактивов.
111.5. Выращивание культур бактерий.
111.6. Выращивание бактериофагов.
111.7. Высев бактерий и бактериофагов. Опыты по изучению эффективности рестрикции.
111.7.1. Высев бактерий.
111.7.2. Высев бактериофагов.
111.7.3. Опыты по изучению эффективности рестрикции.
111.8. Методы работы с плазмидной ДНК.
III.8.1. Выделение ДНК малых плазмид для аналитических опытов.
Ш.8.2. Очистка плазмид в равновесном градиенте плотности CsCl.
111.8.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
111.8.4. Электроэлюция фрагментов ДНК из агарозного геля.
111.8.5. Рестрикционный аиализ плазмид.
111.8.6. Протокол клонирования фрагментов ДНК в вектор.
111.9. Получение однотяжевых ДНК-матриц.
ШЛО. Фосфорилироваиие синтетических олигонуклеотидов.
111.11. Сайт-направленный мутагенез.
II.12. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
III. 12.1.Проведение реакций секвенирования.
Ш.12.2.Приготовление сиквенсных гелей. Сиквенсный электрофорез.
III. 13. Получение делеций с помощью Bal 31 нуклеазы.
1П.14. Полимеразная цепная реакция.
III. 15. Мечение фрагмента ДНК при помощи реакции ПЦР.
111.16. Идентификация белков в системе экспрессии на основе Т7 РНК полимеразы.
ГП.17. Идентификация белков в системе экспрессии на основе
Т7 РНК полимеразы с включением S-Met.
Ш.18. Фракционирование клеточных белков.
111.19. Электрофорез белков в денатурирующих условиях.
III. 19.1.Подготовка образцов для анализа.
Ш.19.2.Проведение электрофореза.
111.20. Замедление подвижности ДНК в геле.
111.21. Измерение промоторной активности с использованием системы вектора рКК232-8.
111.22. Очистка белков при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA колонке.
111.23. Связывание белков in vitro.
111.24. Определение агрегатного состояния белка ArdA, с использованием метода гель-фильтрации.
1П.25. Ингибирование рестрикции немодифицированной
ДНК pBR322 in vitro.
IV. Результаты и их обсуждение.
IV. 1. Картирование области белка ArdA, существенной для его функционирования с помощью тонкого делеционного анализа.
IV.2. Идентификация аминокислотных остатков белка ArdA, которые существенны для его функционирования.
IV.3. Изучение взаимодействия [35Б]-меченных белка ArdA и
EcoKI метилтрансферазы in vitro.
IV.4. Определение агрегатного состояния белка ArdA в растворе.
IV.5. Белок ArdA блокирует способность R-M системы
1-го типа связываться со специфической немодифицироваппой ДНК.92 IV.6. Белок ArdA способен ингибировать ЕсоК1-рестрикцию модифицированной ДНК in vitro.
IV.7. Белок ArdA более эффективно ингибирует рестрикциониую, чем модификационную активность ЕсоК1-системы in vivo.
V. Выводы.