ДНК/РНК-гидролизующий фрагмент фактора дифференцировки 8,2 кДа клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека: Идентификация и свойства Драницына, Светлана Михайловна

Краткое описание

Драницына, Светлана Михайловна.
ДНК/РНК-гидролизующий фрагмент фактора дифференцировки 8,2 кДа клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека : Идентификация и свойства : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10. - Москва, 2000. - 152 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат химических наук Драницына, Светлана Михайловна
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ; ИХ РОЛЬ В АПОПТОЗЕ.
1. Проблема белково-нуклеинового узнавания.
1.1. Сайт-специфические ферменты.
1.2. Сайт-неспецифические белки.
2. Исследования молекулярного механизма функционирования нуклеаз.
3. Апоптоз - генетически контролируемая форма клеточной гибели.
4. Роль нуклеаз в апоптозе.
5. Активные формы кислорода (АФК) в апоптозе.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Идентификация фрагмента НЕБЕ, потенциально обладающего ДНК/РНК-гидролизующей активностью.
2. Клонирование кДНК Н1ЮР-8 в хорошо экспрессирующий вектор приводит к подавлению его экспрессии.
3. Определение нуклеотид связывающей способности синтезированных пептидов.
4. Исследование механизма нуклеолитической реакции.
5. Влияние Ни)Р-8 на клетки НЬ-60.
6. Использование поликлональных антител против НЬБР и НЬБР-8 в качестве иммуногистохимических маркеров ранних неопластических процессов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы.
2. Методы.
2.1. Приготовление агарозного геля.
2.2. Выделение плазмидной ДНК Е. coli методом щелочного лизиса.
2.3. Рестрикция и картирование фрагментов ДНК.
2.4. Перенос ДНК на мембрану по методу Саузерна.
2.5. Иммобилизация ДНК из Е. coli на нитроцеллюлозных фильтрах.
2.6. Ник-трансляция ДНК.
2.7. Радиоактивное мечение олигодезоксирибонуклеотидных зондов.
2.8. Блот-гибридизация по Саузерну. Гибридизация in situ бактериальных колоний и фаговых бляшек.
2.9. Выделение ДНК из агарозы.
2.10.Лигировани е.
2.11 .Получение компетентных клеток Е. coli.
2.12.Трансформация компетентных клеток Е. coli.
2.13.Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
2.14.0тбор рекомбинантных клонов с помощью ПЦР.
2.15.Определение нуклеотидных последовательностей по методу Сенгера.
2.16.Продукция гибридного белка в клетках Е. coli В834.
2.17Лизис клеток-продуцентов.
2.18.Анализ продуктов экспрессии.
2.19.0пределение JV-концевых аминокислотных последовательностей.
2.20.Получение поликлональных антител.
2.21.Культивирование клеток HL-60.
2.22.0пределение дифференцирующей активности.
2.23.Синтез и очистка пептидов.
2.24.0пределение нуклеазной активности.
2.25.Частичная апуринизация ДНК плазмиды pSp65.
2.26.Спектр поглощения HLDF-8.
2.27.Хроматографический анализ взаимодействия синтетических пептидов с олигонуклеоти дами.
2.28. Введение флуоресцентных меток.
229.N- Концевой аминокислотный анализ.
2.30.Анализ деградации яДНК клеток HL-60 под действием различных индукторов.
2.31.МТТ-тес т.
2.32.0ценка количества клеток, вступивших в апоптоз с помощью проточного цитофлуориметра.
2.33. Прижизненное окрашивание клеток HL-60.
2.34.Иммуногистохимическое окрашивание клеток HL-60.
2.35.Трансфекция НЫ)Р в клетки НЬ-60 с помощью унифектина.
2.36.Имуногистохимический анализ среза ткани предстательной железы человека.
ВЫВОДЫ.