Функціональний аналіз бета-дефенсину-2 в злоякісно трансформованих клітинах

Краткое описание

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького.

На правах рукопису

УДК:616-006.6:577.113:577.122.5

Журавель Олена Валентинівна

Функціональний аналіз бета-дефенсину-2 в злоякісно трансформованих клітинах

14.01.07 онкологія”

Дисертація
на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Науковий керівник:
Погрібний Петро Васильович,
професор, доктор біологічних наук

Київ 2009

Зміст

Список скорочень

6

ВСТУП

8

1.ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

17

1.1.Загальна характеристика пептидних антибіотиків

17

1.2.Структура та функції антимікробних пептидів ссавців

17

1.3.Дефенсини як прямі ефектори антимікробного захисту

20

1.4.Дефенсини як регулятори природного імунітету

21

1.5.Роль дефенсинів в формуванні адаптивної імунної відповіді

23

1.5.1.Хемотактична активність антимікробних пептидів ссавців

24

1.5.2. Ідентифікація хемокінових рецепторів антимікробних пептидів

25

1.5.3. Дефенсини як хемокіни

27

1.5.4. Імуноад’ювантні властивості дефенсинів

29

1.5.5.Регуляція експресії дефенсинів

30

1.5.6. Гіпотетичні механізми участі дефенсинів у формуванні адаптивної імунної відповіді

32

1.6. Протипухлинна активність антимікробних пептидів

35

1.7. Можливість використання дефенсинів в імунотерапії раку

38

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

44

2.1. Характеристика експериментальних моделей

44

2.2. Штами мікроорганізмів

44

2.3. Методи культури клітин

45

2.3.1.Умови культивування клітинних ліній

45

2.3.2. Трансфекція еукаріотичних клітин

45

2.3.3. Тест на колонієутворення

45

2.4. Отримання клітинних лізатів та визначення концентрації білків

46

2.5. Молекулярно-біологічні методи

46

2.5.1. Реакція зворотньої транскрипції

46

2.5.2. Полімеразна ланцюгова реакція

47

2.5.3. Рестриктний аналіз

48

2.5.4. Лігазна реакція

48

2.6. Біохімічні методи досліджень

48

2.6.1. Виділення РНК

48

2.6.2. Електрофорез РНК та визначення концентрації нуклеїнових кислот

49

2.6.3. Виділення плазмідної ДНК

50

2.6.4. Електрофорез ДНК в агарозному гелі

51

2.6.5. Елюція ДНК із агарозного гелю

52

2.6.6. Електрофорез ДНК в поліакриламідному гелі

53

2.6.7. Електрофорез білків

53

2.6.8.Афінна хроматографія

54

2.6.9. Гель-фільтрація

54

2.6.10. Зворотньофазова хроматографія

55

2.7. Імунологічні методи

55

2.7.1. Western blot аналіз

55

2.7.2. Імуноферментний метод (ELISA)

57

2.7.3. Імуноцитохімія

57

2.8. Мікробіологічні методи

59

2.8.1. Культивування бактеріальних культур

59

2.8.2. Отримання компетентних клітин

59

2.8.3. Трансформація бактеріальних культур

60

2.8.4. Антимікробний тест

61

2.9. Радіоізотопні методи

61

2.9.1. Визначення індексу пригнічення синтезу ДНК в культивованих клітинах

61

2.10. Експерименти in vivo

62

2.11.Статистична обробка результатів

62

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

64

3.1. Клонування повної та процесованої форми гена бета-дефенсину-2 людини (hBD-2) у системі регульованої експресії та отримання відповідних клітинних ліній

64

3.2. Дослідження впливу ендогенного hBD-2 на морфологію, проліферативні та туморогенні властивості клітин

73

3.3. Вплив ендогенного hBD-2 на експресію p70S6Ka і p70S6Kb in vitro та інгібування активації рибосомального S6 білка.

79

3.4. Клонування бета-дефенсину-2 миші (mBD-2), його експресія в бактеріальній системі та очистка рекомбінантного продукта

83

3.5. Створення клітинних ліній 3LLmBD-2, 3LLIgkmBD-2, 3LLpcDNA3 з різним рівнем експресії mBD-2 та дослідження їх властивостей в моделі in vitro

90

3.6. Аналіз впливу b-дефенсину-2 на туморогенні властивості клітин в моделі in vivo

100

4. ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

103

ВИСНОВКИ

114

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

115

Список скорочень:

hBD (human b-defensin) бета-дефенсин людини
HNP (human neutrophil peptide) пептид нейтрофілів людини
mBD (mouse b-defensin) бета-дефенсин миші
iDC (immature dendritic cells) незрілі дендритні клітини
mDC (mature dendritic cells) зрілі дендритні клітини
IgM (immunoglobulin M) імуноглобулін М
TNF (tumor necrosis factor) фактор некрозу пухлин
IL (interleukine) - інтерлейкін
MIP-3a - (macrophage inflammatory protein 3a) запальний білок 3a макрофагів
TLR (Toll like receptor) Toll like-рецептор
LARC (Liver аctivation-regulated chemokine) LAR-хемокін
OVA (ovalbumin) овальбумін
KLH (keyhole limpet hemocyanin) гемоцианін
INFg - (interferon g) інтерферон гамма
HEK293 (human embrionic kidney 293) ембріональні клітини нирки
NAP-2 (neutrophil asossiated peptide 2) пептид 2 нейтрофілів
МНС (major histocompatibility complex) головний комплекс гістосумісності
CTL цитотоксичні Т лімфоцити
APC (antigen-presenting cells) антиген-презентуючі клітини
PAMPs (Pathogen associated molecular pattern) молекулярні паттерни, асоційовані з патогеном
МАРК (mitogen activated protein kinase) мітоген-активована протеїнкіназа
3LL клітини карциноми легені Л’юїс
3LLmBD-2 клітини карциноми легені Л’юїс, трансфіковані вектором pcDNA3mBD-2
3LLIgkmBD-2 клітини карциноми легені Л’юїс, трансфіковані вектором pSecTag2mBD-2
3LLpcDNA3 клітини карциноми легені Л’юїс, трансфіковані вектором pcDNA3.1+
HEKhBD-2Mat, HEKhBD-2Pr, HEKpcDNA4 ембріональні клітини нирки, трансфіковані плазмідними векторами pcDNA4neoMat та pcDNA4neoPr, що експресують процесовану та непроцесовану форми hBD-2, а також пустим вектором, відповідно.

ВСТУП

Актуальність проблеми
Дослідження молекулярно-генетичних механізмів канцерогенезу є одним з основних напрямків сучасної фундаментальної онкології. При неопластичній трансформації в клітині відбуваються значні зміни, які призводять до формування злоякісного фенотипу, основними характеристиками якого є самодостатність щодо проліферативних сигналів, нечутливість до ріст-супресуючих факторів, відсутність реплікативного старіння (іморталізація), послаблення індукції апоптозу, блокування клітинного диференціювання, генетична нестабільність, здатність стимулювати неоангіогенез, зміни в морфології та рухливості клітин [1]. Ці властивості забезпечуються широким спектром біологічно активних молекул, серед яких особливе місце займають молекули імунної системи. Як свідчать дослідження останніх років, досить важливу роль на різних стадіях імунної відповіді відіграють дефенсини невеликі антимікробні катіонні пептиди. Нещодавно було виявлено, що ці природні антибіотики мають широкий спектр біологічної активності. Дефенсини можуть діяти як хемоатрактанти по відношенню до Т-клітин in vitro та in vivo [2 5], а також безпосередньо індукувати визрівання дендритних клітин [6]. Таким чином, дефенсини приймають участь у взаємодії між різними типами клітин імунної системи, підсилюють продукцію специфічних антитіл [7], і, крім того, впливають на ріст, проліферацію та диференціювання клітин [8 12]. Також є свідчення щодо участі дефенсинів в процесах регуляції активності ряду кіназ компонентів сигнальних каскадів клітини [13 15].
Останнім часом значно зросла кількість публікацій, присвячених ролі дефенсинів в канцерогенезі [16 23]. Дані кількох груп дослідників продемонстрували відсутність експресії hBD-1 в новоутвореннях нирки та простати, а також зниження її рівня при плоскоклітинній карциномі ротової порожнини [16 18]. В той же час було встановлено, що при індукції експресії hBD-1 в пухлинних клітинах спостерігається цитотоксичний ефект [17], що вказує на можливу роль дефенсину як потенційного пухлинного супрессора. Нещодавно були отримані подібні результати і щодо експресії hBD-2 в пухлинах різної локалізації [18, 19].
Також є дані про гіперекспресію альфа- або бета-дефенсинів в пухлинах легені, сечового міхура, товстої кишки, вульви, шийки матки та язика [20 23]. Наведені приклади свідчать про участь дефенсинів в пухлинному процесі, але функції цих білків в клітині, як і регуляторні механізми, що призводять до реалізації тієї чи іншої програми, до кінця не з`ясовані.
Крім того, було встановлено, що дефенсини, завдяки своїм хемотактичним властивостям щодо до клітин імунної системи, а також здатності активувати дендритні клітини, можуть бути використані в клінічній онкології як ад`юванти при вакцинотерапії або як носії для доставки антигена до антиген презентуючих клітин (APC) [24].
Аналіз даних світової літератури показав, що, не дивлячись на все зростаючу кількість робіт, присвячених вивченню дефенсинів, досліджень щодо участі цих пептидів в пухлинному процесі обмаль, і ці питання в значній мірі залишаються нерозкритими.
Разом з тим для ефективного застосування дефенсинів в онкологічній практиці конче необхідним є дослідження механізмів їх дії на систему передачі сигналів в клітині та вивчення особливостей функціонування цих пептидів в злоякісно трансформованих клітинах. Особливо перспективним об’єктом досліджень з точки зору фундаментальної онкології є бета-дефенсин-2 пептид, що експресується епітеліальними клітинами і характеризується широким спектром біологічної дії від антимікробної до хемотактичної.
Таким чином дослідження біологічної активності та функцій бета-дефенсину-2 в малігнізованих епітеліальних клітинах in vitro та дослідження його потенційних протипухлинних властивостей в експериментах in vivo є актуальними як для експериментальної так і клінічної онкології.
Ці завдання були сформульовані та реалізовані в програмах наукових досліджень НАН України. Роботу було виконано в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відділі регуляторних механізмів клітин в рамках планових науково-дослідних робіт Інституту як фрагмент теми 2.2.5.298 „Вивчення імуномодулюючої та протипухлинної дії рекомбінантного бета-дефенсину-2” (2007 2010 рр., № державної реєстрації 0106U005544) і теми 2.2.5.303 „Розробка технології імунотерапії пухлин з використанням оригінальних протипухлинних вакцин, цитокінів та ад’ювантів” (2007 2011 рр., № державної реєстрації 0107U002243), а також в рамках програми наукових досліджень „Новітні медико-біологічні проблеми та навколишнє середовище людини” (шифр теми 2.2.5.289 „Отримання рекомбінантного hBD-2 з використанням двохвекторної системи експрессії в клітинах ссавців” (2004 2006 рр., № державної реєстрації 0104U006137) і теми 2.2.5.317 „Створення та апробація в системі in vivo протипухлинних ДНК-вакцин на основі бета-дефенсина-2, злитого з пухлино-асоційованим антигеном” (2007 2009 рр., № державної реєстрації 0107U005545).

Мета та задачі дослідження.
З’ясувати функціональну роль бета-дефенсину-2 в злоякісно трансформованих клітинах з використанням модельних систем in vitro та in vivo.

У відповідності з вказаною метою були сформульовані наступні експериментальні задачі:

1. Розробити та сконструювати клітинні моделі, в яких, на відміну від вихідної клітинної лінії, експресується процесована та непроцесована форми гена hBD-2.
2. Дослідити вплив експресії hBD-2 на проліферацію та клоногенну активність модельних клітинних ліній.
3. Для дослідження функціональної ролі бета-дефенсину-2 в моделі in vivo створити на основі клітин карциноми легені Л’юїс (3LL) миші клітинні лінії, що відрізняються за рівнем експресії гена mBD-2.
4. Провести порівняльний аналіз рівня експресії мРНК mBD-2 в створених клітинах і у вихідній лінії 3LL.
5. Оцінити проліферативний потенціал та клоногенну активність клітин лінії 3LL та створених трансфектних клітинних ліній в експериментах in vitro.
6. Визначити вплив бета-дефенсину-2 на розвиток експериментальних пухлин, отриманих з трансфікованих клітин та клітин вихідної лінії 3LL.

Об’єкт дослідження: культури клітин ліній HEK293 і 3LL дикого типу та клітин, трансфікованих векторами, що містять кДНК hBD-2 та mBD-2, відповідно.

Предмет дослідження: експресія генів hBD-2 та mBD-2, проліферативні показники клітин та їх здатність до колонієутворення, швидкість росту експериментальних пухлин.

Методи дослідження: молекулярно-біологічні (ПЛР, ЗТ-ПЛР, рестрикція, лігування, молекулярне клонування, трансфекція), біохімічні та фізико-хімічні (виділення та аналіз нуклеїнових кислот, електрофорез нуклеїнових кислот в агарозному та поліакриламідному гелі, електрофорез білків в поліакриламідному гелі, афінна хроматографія та гель-фільтрація), мікробіологічні (трансформація та культивування бактерій), імунологічні (імуно-ферментний аналіз, Вестерн-блот аналіз, імуноцитохімія); радіоізотопні (визначення включення 3[Н]-тимідину); методи культури клітин (аналіз колонієутворення).

Наукова новизна одержаних результатів.
Вперше на моделях in vitro та in vivo була доведена роль бета-дефенсину-2 як потенційного супресора пухлинного росту.
Вперше отримано клітинні сублінії на основі лінії HEK293, що експресують секреторну та внутрішньоклітинну форми hBD-2. На цих сублініях вперше показано, що внутрішньоклітинне накопичення hBD-2 в пікограмових концентраціях призводить до зниження проліферативної активності клітин та здатності їх до колонієутворення, характерних для клітин вихідної лінії.
Встановлено, що hBD-2 стимулює експресію a і b ізоформ p70SK6 кінази, але призводить до пригнічення активації S6 білка одного з основних компонентів апарату білкового синтезу.
Вперше отримано унікальну модельну систему клітинних субліній, що походять від клітин карциноми легені Л’юїс (3LL) та відрізняються за рівнем експресії мРНК mBD-2. На створених модельних клітинах показано, що пригнічення експресії мРНК mBD-2 супроводжується зміною певних характеристик клітинної популяції, а саме: збільшенням проліферативної активності клітин та їх здатності до колонієутворення.
В експериментах in vivo при використанні трансплантованих клітин 3LL вперше показано, що існує зворотня кореляція між рівнем експресії мРНК mBD-2 та швидкістю росту пухлин.

Практичне значення роботи.
Результати дисертаційної роботи розширюють сучасні уявлення про спектр біологічної активності дефенсинів компонентів імунної системи, що можуть відігравати роль складових протипухлинного захисту. Отримані дані можуть бути теоретичним підґрунтям для розробки нової стратегії лікування хворих на злоякісні новоутворення шляхом стимуляції імунітету.
З позицій фундаментальної онкології суттєве значення має розробка та створення модельних клітинних ліній одного походження, які відрізняються рівнем експресії b-дефенсину-2, що призводить до зміни фенотипових характеристик клітинної популяції.

Апробація результатів дисертації.
Матеріали дисертації були представлені та обговорені на: Міжнародній конференції „Basic Science for Biotechnology and Medicine” (Новосибірск, 2006), VII Міжнародній конференції молодих онкологів „Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології” (Київ, 2006), IX Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006), VIII Міжнародній конференції молодих онкологів „Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології” (Київ, 2007), Міжнародній конференції Tumor hypoxia and malignant progression” (Київ, 2008).

Публікації.
За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті у провідних фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, та 5 тез доповідей у збірках матеріалів науково-практичних конференцій і з’їздів.

Структура та обсяг дисертації
Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису використаних в роботі матеріалів та методів, викладення результатів власних досліджень, обговорення результатів, висновків та списка літератури. Матеріали дисертації викладені на 114 сторінках машинописного тексту, містять 30 рисунків, 3 таблиці та список літератури з 170 джерел.

Список литературы

ВИСНОВКИ
В роботі визначено функцію бета-дефенсину-2 як потенційного супресора росту пухлинних клітин in vitro та in vivo.
1. З використанням генно-інженерних технологій на основі лінії клітин ембріональної нирки людини НЕК293 були створені клітинні лінії HEKhBD-2Mat та HEKhBD-2Pr, які експресують несекреторну та секреторну форми hBD-2, відповідно.
2. Встановлено, що експресія hBD-2 в клітинній сублінії HEKhBD-2Pr призводить до зниження показників колонієутворення в порівнянні з відповідними показниками в клітинах вихідної лінії, а в клітинах HEKhBD-2Mat до достовірного зниження синтезу ДНК, пригнічення фосфорилювання рибосомного S6 білка, а також до втрати клоногенної активності клітин у напіврідкому середовищі.
3. На основі лінії клітин карциноми легені Л’юїс (3LL) створено трансфіковані клітинні лінії 3LLmBD-2 та 3LLIgkmBD-2, які експресують процесовану та непроцесовану форми гена mBD-2.
4. Показано, що в трансфікованих клітинних лініях 3LLmBD-2 та 3LLIgkmBD-2 рівень експресії мРНК дефенсину знижений у порівнянні з клітинами дикого типу, для яких характерна конститутивна експресія гена mBD-2.
5. Встановлено, що пригнічення експресії мРНК mBD-2 в клітинних сублініях 3LLmBD-2 і 3LLIgkmBD-2 призводить до підвищення показників колонієутворення та проліферації у порівнянні з контрольними клітинами в моделі in vitro.
6. Продемонстровано, що експериментальні пухлини, отримані з трансфікованих клітин миші 3LLmBD-2 і 3LLIgkmBD-2 характеризуються достовірно більш високою швидкістю росту, ніж пухлини контрольних штамів.

Список літератури
1. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза / Б.П. Копнин // Биохимия. 2000. Т. 65. С. 5-33.
2. Identification of defensin-1, defensin-2, and CAP37/azurocidin as T-cell chemoattractant proteins released from interleukin-8-stimulated neutrophils / O. Chertov, D. F. Michiel, L Xu.Wang, et al. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 2935-2940
3. T lymphocyte recruitment by interleukin-8 (IL-8). IL-8-induced degranulation of neutrophils releases potent chemoattractants for human T lymphocytes both in vitro and in vivo / D. D. Taub, M. Anver, J. J. Oppenheim, et al. // J. Clin. Invest. 1996. V. 97. P. 1931-1941
4. Human neutrophil defensins selectively chemoattract naïve T and immature dendritic cells / D. Yang, Q. Chen, O. Chertov, et al. // J. Leukoc. Biol. 2000. V. 68. P.9-14
5. ß-Defensins: linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6 / D. Yang, O. Chertov, S. N. Bykovskaia, et al/ // Sci. 1999. V. 286. P. 525-528
6. Toll-like receptor 4-dependent activation of dendritic cells by beta-defensin-2 / A. Biragin, P.A. Ruffini, C.A. Leifer, et al. // Sci. 2002. V. 298. P. 1025-1029
7. Mechanisms for induction of acquired host immunity by neutrophil peptide defensins/ J.W. Lillard, Jr. Boyaka, N. Prosper et al.//Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. V. 96. P. 651656
8. Defensins are mitogenicfor epithelial cells and fibroblasts / C.J. Murphy, B.A. Foster, M.J. Mannis, et al. // J. Cell Physiol. 1993. V. 155. P.408-413
9. Human neutrophil defensins induce lung epithelial cell proliferation in vitro / J. Arabiou, J. Ertmann, S. van Wetering, et al. // J. Leukoc. Biol. 2002. V.72. P.167-174
10. Neutrophil defensins enhance lung epithelial wound closure and mucin gene expression in vitro/ J. Aarbiou, R.M. Verhoosel, S. Van Wetering, et al. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2004. V.30. №2. P. 193-201
11. Human beta-defensin-2 production in keratinocytes is regulated by interleukin-1, bacteria, and the state of differentiation / A.Y. Liu, D. Destoumieux, A.V. Wong, et al. // J. Invest. Dermatol. 2002. V. 2, №118. P. 275-281.
12. Effect of defensin peptides on eukaryotic cells: primary epithelial cells, fibroblasts and squamous cell carcinoma cell lines / M. Nishimura, Y. Abiko, Y. Kurashige, et al. // J. Dermatol. Sci. 2004. V. 36, №2. P. 87-95
13. Li J. Stimulation of specific cytokines in human conjunctival epithelial cells by defensins HNP1, HBD2, and HBD3 / J. Li, H.Y. Zhu, R.W. Beuerman // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009. V. 50, № 2. P. 644-53.
14. Up-regulation of human beta-defensin 2 by interleukin-1beta in A549 cells: involvement of PI3K, PKC, p38 MAPK, JNK, and NF-kappaB / B.C. Jang, K.J. Lim, J.H. Paik, et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 3, №320. P. 1026-1033.
15. Krisanaprakornkit S. Regulation of human beta-defensin-2 in gingival epithelial cells: the involvement of mitogen-activated protein kinase pathways, but not the NF-kappaB transcription factor family / S. Krisanaprakornkit, J.R. Kimball, B.A. Dale // J. Immunol. 2002. V. 1, №168. P. 316-324.
16. Human b-defensin-1, a potential chromosome 8p tumor suppressor: control of transcription and induction of apoptosis in renal cell carcinoma / C.Q. Sun, R. Arnold, C. Fernandez-Golarz, et al. // Can. Res. 2006. V.66. P. 8542 8549
17. Functional analysis of the host defense peptide Human Beta Defensin-1: New insight into its potential role in cancer / R.S. Bullard, W. Gibson, S.K. Bose, et al. // Molecular Immunology 2008. V. 45. P. 839848
18. Decreased gene expression of human β-defensin-1 in the development of squamous cell carcinoma of the oral cavity / M. Wenghoefer, A. Pantelis, H. Dommisch, et al. // International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 2008 V. 37, Issue 7. P. 660-663.
19. Defensins induce the recruitment of dendritic cells in cervical human papillomavirus-associated (pre)neoplastic lesions formed in vitro and transplanted in vivo / H. Pascale, H. Ludivine, M. Catherine, et al. // The FASEB Journal. 2007. V. 21. P. 2765-2775.
20. Identification and overexpression of human neutrophil _-defensins (human neutrophil peptides 1, 2 and 3) in squamous cell carcinomas of the human tongue / F.T. Lundy, D.F. Orr, J.R. Gallagher, et al. // Oral Oncology. 2004. V. 40. P. 139144.
21. Upregulated expression of human neutrophil peptides 1, 2 and 3 (HNP 1-3) in colon cancer serum and tumours: a biomarker study/ J. Albrethsen, R. Bogebo, S. Gammeltoft, et al. // BMC Cancer.- 2005.- V.5.- Р.8.
22. Elevated serum beta-defensins concentrations in patients with lung cancer/ Y. Arimura, J. Ashitani, S. Yanagi, et al. // Anticancer Res.- 2004.- V.24.- Р. 4051-4057.
23. Discovery and identification of alpha-defensins as low abundant, tumor-derived serum markers in colorectal cancer/ C. Melle, G. Ernst, B. Schimmel, et al. // Gastroenterology.- 2005.- V.129.- Р. 66-73.
24. Biragyn A. Defensins non-antibiotic use for vaccine development / A. Biragyn // Current protein and peptide science. 2005. V. 6. P. 53 60.
25. Gabay J.E. Ubiquitos natural antibiotics / J.E. Gabay // Sci. 1994. V. 264. P. 373-374
26. Nissen-Meyer J., Nes I.F. Ribosomally synthesized antimicrobial peptides: their function, structure, biogenesis and mechanism of action / J. Nissen-Meyer, I.F. Nes // Arch. Microbiol. 1997. V. 167. P. 67-77
27. Patil A. Rapid evolution and diversification of mammalian _-defensins as revealed by comparative analysis of rodent and primate genes / A. Patil, A.L. Hughes, G. Zhang //Physiol. Gen. 2004. V. 20. P. 111
28. Lehrer R.I. Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defense / R.I. Lehrer, T. Ganz // Curr. Opin. Immunol. 1999. V. 11. P. 23-27
29. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts/ M. Benincasa, M. Scocchi, S. Pacor, et al. // J Antimicrob Chemother. 2006. V. 5, № 85. P. 950-9.
30. Ganz T. Defensins / Tomas Ganz. Los Angeles.: Medicine and Pathology: School of Medicine, University of California, 2000. 322 c.
31. Izadpanah A. Antimicrobial peptides / A. Izadpanah, R.L. Gallo // J Am. Acad. Dermatol. 2005. V. 52, № 3. P. 381-387.
32. Ganz, T., Lehrer, R. I. Defensins//Curr. Opin. Immunol. 1994. V. 4. P.584-589
33. Zanetti M. Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal anti-microbial domain / M. Zanetti, R. Gennaro, D. Romeo // FEBS Lett. 1995. V. 374. P.1-5
34. Primary structures of three human neutrophil defensins / M.E. Selsted, S.S. Harwig, T. Ganz, et al. // J. Clin. Invest. 1985 V.76., №4. Р. 1436-1439.
35. Defensins. Natural peptide antibiotics of human neutrophils / T. Ganz, M.E. Selsted, D. Szklarek, et al. // J. Clin. Invest. 1985. V.76., №4. Р. 1427-1435.
36. A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated alpha-defensins / Y.Q. Tang, J. Yuan, G. Osapay, et al. // Sci. 1999. V.286, №5439. P. 498-502.
37. Retrocyclin: a primate peptide that protects cells from infection by T- and M-tropic strains of HIV-1 / A.M. Cole, T. Hong, L.M. Boo, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2002. V.99, №4. P. 1813-1818.
38. Tang, Y-Q. Characterization of the disulfide motif in BNBD-12, an anti-microbial ß-defensin peptide from bovine neutrophils / Y-Q. Tang, M. E. Selsted // 1993. - J. Biol. Chem. V. 268. P. 6649-6653
39. Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimer: mechanisms of membrane permeabilization / C.P. Hill, J. Yee, M.E. Selsted, et. al. // Sci. 1991. V.251, №5000. P. 14811485.
40. Solution structures of the rabbit neutrophil defensin NP-5 / A. Pardi, D.R. Hare, M.E. Selsted, et al. // J. Mol. Biol. 1988. V.201, №3. P. 625-636.
41. NMR studies of defensin antimicrobial peptides. Three-dimensional structures of rabbit NP-2 and human HNP-1 / A. Pardi, X.L. Zhang, M.E. Selsted, et al. //Biochem. 1992. V.31, №46. P. 11357-11364.
42. Zhang X.L. 1. NMR studies of defensin antimicrobial peptides. 1. Resonance assignment and secondary structure determination of rabbit NP-2 and human HNP-1 / X.L. Zhang, M.E. Selsted, A. Pardi //Biochem. 1992. V.31, №46. P. 11348-56.
43. Skalicky J.J. Structure and dynamics of the neutrophil defensins NP-2, NP-5, and HNP-1: NMR studies of amide hydrogen exchange kinetics / J.J. Skalicky, M.E. Selsted, A. Pardi // Proteins. 1994. V.20, №1. P. 52-67.
44. Solution structure of bovine neutrophil beta-defensin-12: the peptide fold of the beta-defensins is identical to that of the classical defensins / G.R. Zimmermann, P. Legault, M.E. M.E. Selsted, et.al. // Biochemistry. 1995. V.34, №41. P. 13663-13671.
45. The structure of human beta-defensin-2 shows evidence of higher order oligomerization / D.M. Hoover, K.R. Rajashankar, R. Blumenthal, et al. //J. Biol. Chem. 2000. V.275, №42. P. 3291132918.
46. The NMR structure of human beta-defensin-2 reveals a novel alpha-helical segment / M.V. Sawai, H.P. Jia, L. Liu, et al. // Biochem. 2001. V.40, №13. P. 38103816.
47. Defensins knoledgebase [electronic resources]: A collaboration between Bioinformatics institute and Singapure eyeresearch institute. Режим доступу: http://defensins.bii.a-star.edu.sg/
48. Defensins: natural peptide antibiotics of human neutrophils . T. Ganz, M. E. Selsted, D. Szklarek, et al. // J. Clin. Invest. 1985. V. 76. P. 1427-1435
49. Purification and characterization of human neutrophil peptide 4, a novel member of the defensin family / C. G. Wilde, J. E. Griffith, L. Marra, et al. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 11200-11203
50. Human CAP18: a novel anti-microbial lipopolysaccharide-binding protein / J. W. Larrick, M. Hirata, R. F. Balint, et al. // Infect. Immun. 1995. V. 63. P. 1291-1297
51. Cowland, J. B. hCAP-18, a cathelin/pro-bactenecin-like protein of human neutrophil specific granules / J. B. Cowland, A. H. Johnsen, N. Borregaad // FEBS Lett. 1995. V. 368. P. 173-176
52. FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis / B. Agerberth, H. Gunne, J. Odeberg, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 195-199
53. Identification of defensin-1, defensin-2, and CAP37/azurocidin as T-cell chemoattractant proteins released from interleukin-8-stimulated neutrophils / O. Chertov, D. F. Michiel, L. Xu, et al. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 2935-2940
54. Ganz T. Extracellular release of anti-microbial defensins by human polymorphonuclear leukocytes / T. Ganz //Infect. Immun. 1987. V. 55. P. 568-571
55. T lymphocyte recruitment by interleukin-8 (IL-8). IL-8-induced degranulation of neutrophils releases potent chemoattractants for human T lymphocytes both in vitro and in vivo / D. D. Taub, M. Anver, J.J. Oppenheim, et al. // J. Clin. Invest. 1996. V. 97. P. 1931-1941
56. Ouellette A. J.Paneth cell defensins: endogenous peptide components of intestinal host defense / A. J. Ouellette, M. E. Selsted // FASEB. 1996. V. 10. P. 1280-1289
57. Human enteric defensins: gene structure and developmental expression / E. B. Mallow, A. Harris, N. Salzman, et al. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 4038-4045
58. Localization of human intestinal defensin 5 in Paneth cell granules / E. M. Porter, L. Liu, A. Oren, et al. // Infect. Immun. 1997. V. 65. P. 2389-2395
59. Detection of human defensin 5 in reproductive tissues / D. M. Svinarich, N. A. Wolf, R. Gomez, et al. // Am. J. Obstet. Gynecol. 1997. V. 176. P. 470-475
60. HBD1: a novel ß-defensin from human plasma / K. W. Bensch, M. Raida, H-J. Magert, et al. // FEBS Lett. 1995. V. 368. P. 331-335
61. Zhao C. Widespread expression of ß-defensin HBD1 in human secretory glands and epithelial cells FEBS / C. Zhao, I. Wang, R. I. Lehrer // Lett. 1996. V. 396. P. 319-322
62. McCray P. B. Human airway epithelia express a ß-defensin / P. B. McCray, L. Bentley // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1997. V. 16. P. 343-349
63. Human ß-defensin-1 is a salt-sensitive antibiotic in lung that is inactivated in cystic fibrosis / M. J. Goldman, G. M. Anderson, E. D. Stolzenberg, et al. //Cell. 1997. V. 88. P. 553-560
64. Production of beta-defensins by human airway epithelia / P. K. Singh, Jia, H. P., Wiles, K., //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 14961-14966
65. Human ß-defensin-1: an anti-microbial peptide of urogenital tissues / E. V. Valore, C. H. Park, A. J. Quayle, et al. // J. Clin. Invest. 1998. V. 101. V. 1633-1642
66. Expression of the peptide antibiotic human ß-defensin 1 in cultured gingival epithelial cells and gingival tissue / S.Krisanaprakornkit, A. Weinberg, C. N. Perez, et al. // Infect. Immun. 1998. V. 66. P. 4222-4228
67. Production of beta-defensin anti-microbial peptides by the oral mucosa and salivary glands / M. Mathews, H. P. Jia, J. M. Guthmiller, et al. // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 2740-2745
68. Kagnoff M. F. Expression and regulation of the human beta-defensins HBD1 and HBD-2 in intestinal epithelium / M. F. Kagnoff //J. Immunol. 1999. V. 163. P. 6718-6724
69. A peptide antibiotic from human skin / J. Harder, J. Bartels, E. Christophers, et al. // Nature. 1997. V. 387. P. 861
70. McCray, P. B. Human airway epithelia express a ß-defensin / P. B. McCray, L. Bentley //Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1997. V. 16. P. 343-349
71. Production of beta-defensins by human airway epithelia / P. K. Singh, H. P. Jia, K. Wiles, et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 14961-14966
72. Structure and mapping of the human ß-defensin HBD-2 gene and its expression at sites of inflammation / L. Liu, L. Wang, H. Jia, et al. // Gene. 1998. V. 222. P. 237-244
73. Human ß-defensin 2 is a salt-sensitive peptide antibiotic expressed in human lung / R. Bals, X. Wang, Z. Wu, et al. //J. Clin. Invest. 1998. V. 102. P. 874-880
74. Identification of human ß-defensin-2 in respiratory tract and plasma and its increase in bacterial pneumonia / T. Hiratsuka, M. Nakazato, Y. Date, et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 249. P. 943-947
75. The human cationic anti-microbial protein (hCAP18), a peptide antibiotic, is widely expressed in human squamous epithelia and colocalizes with interleukin-6 / M. F. Nilsson, B. Sandstedt, O. Sorensen, et al. //Infect. Immun. 1997 V. 67. P. 2561-2566
76. The expression of the gene coding for the anti-microbial peptide LL-37 is induced in human keratinocytes during inflammatory disorders / M. Frohm, B. Agerberth, G. Ahangari, et al. //J. Biol. Chem. 1997 V. 272. P. 15258-15263
77. The peptide antibiotic LL-37/hCAP-18 is expressed in epithelia of the human lung where it has broad anti-microbial activity at the airway surface / R. Bals, X. Wang, M. Zasloff, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 9541-9546
78. Ganz T. Antimicrobial peptides of vertebrates / T. Ganz, R.I. Lehrer // Curr. Opin. Immunol. 1998. V. 10. P. 41 44.
79. Schröder J.M. Epithelial antimicrobial peptides: innate local host response elements / J.M. Schröder // Cell. Mol. Life Sci. 1999. V. 56. - P. 3246.
80. Interaction of human defensins with Escherichia coli. Mechanism of bactericidal activity / R.I. Lehrer, A. Barton, K.A.Daher, et al. // J. Clin. Invest. 1989. V.84, №2. P. 553561
81. Hristova K. Critical role of lipid composition in membrane permeabilization by rabbit neutrophil defensins / K. Hristova, M.E. Selsted, S.H. White // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 2422424233.
82. The structure of human β-defensin-2 shows evidence of higher order oligomerization / D.M. Hoover, K.R. Rajashankar, R. Blumenthal, et al. //J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 3291132918.
83. Enhancement of phagocytosis by corticostatin I (CSI) in cultured mouse peritoneal macrophages / M. Ichinose, M. Asai, K. Imai, et al. // Immunopharm. 1996. V. 35. P. 103109.
84. Fleischmann J.Opsonic activity of MCP-1 and MCP-2, cationic peptides from rabbit alveolar macrophages / J. Fleischmann, M.E Selsted, R.I. Lehrer // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1985. V. 3. P. 233242.
85. Neutrophil defensins induce histamine secretion from mast cells: mechanisms of action / A.D. Befus, C. Mowat, M. Gilchrist // J. Immunol. 1999. V. 163. P. 947953.
86. Epithelial cell-derived human ß-defensin-2 acts as a chemotaxin for mast cells through a pertussis toxin-sensitive and phospholipase C-dependent pathway / F. Niyonsaba, K. Iwabuchi, H. Matsuda, et al. //Int. Immun. 2002. V. 14, №. 4. P. 421 426.
87. Effect of neutrophil serine proteinases and defensins on lung epithelial cells: modulation of cytotoxicity and IL-8 production / S.Van Wetering, S.P. Mannesse-Lazeroms, J.H. Dijkman, et al. //J. Leukocyte Biol. 1997. V. 62. P. 217226.
88. Baggiolini M. Chemokines and leukocyte traffic / M. Baggiolini // Nature. 1998. V. 392. P. 565568.
89. Neutrophil α-defensin human neutrophil peptide modulates cytokine production in human monocytes and adhesion molecule expression in endothelial cells / Y.V. Chaly, E.M. Paleolog, T.S. Kolesnikova,.et al. //Eur. Cytokine Netw. 2000. V. 11. P. 257260.
90. Defensins purified from human granulocytes bind C1q and activate the classical complement pathway like the transmembrane glycoprotein gp41 of HIV-1 / Z. Prohaszka, K. Nemet, P Csermely., et al. // Mol Immunol. 1997 V. 34, №11. P. 809-816
91. Inhibition of activation of classical pathway of complement by human neutrophil defensins / R.H. Van den Berg, M.C. Faber-Krol, S. Wetering, et al. // Blood 1998. V. 92 P. 38983903.
92. The human antimicrobial and chemotactic peptides LL-37 and α-defensins are expressed by specific lymphocyte and monocyte populations/ B. Agerberth, J. Charo, J. Werr, et al. // Blood. 2000. V. 96. P.30863093.
93. Contribution of human alpha-defensin 1, 2, and 3 to the anti-HIV-1 activity of CD8 antiviral factor / Zhang L., W. Yu, T. He, et al. // Sci. 2002. V.298, №5595. P. 9951000.
94. Evaluation of the inactivation of infectious herpes simplex virus by host-defense peptides / B. Yasin, M. Pang, J.S. Turner, et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. 2000. V. 19. P. 187194.
95. Direct inactivation of viruses by MCP-1 and MCP-2, natural peptide antibiotics from rabbit leukocytes / R.I. Lehrer, K. Daher, T. Ganz, et al. // J. Virol. 1985. V. 54. P. 467472.
96. Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences / K.A. Brogden, M. Ackermann, P.B. McCray, et al. // Int. J. Antimicrob. 2003. V. 22. P. 465 478.
97. Defensins act as potent adjuvants that promote cellular and humoral immune responses in mice to a lymphoma idiotype and carrier antigens / K. Tani, W. J. Murphy, O. Chertov, et al. // Int. Immunol. 2000. V. 12. P. 691-700
98. Identification of a novel, multifunctionnal β-defensin (human β-defensin 3) with specific antimicrobial activity / J.R.C. García, F. Jaumann, S. Schultz, et al. // Cell Tissue Res. 2001. V. 306. P.257264.
99. Human β-defensin 4: a novel inducible peptide with a specific salt-sensitive spectrum of antimicrobial activity / J.R.C. García, A. Krause, S. Schultz, et al. //FASEB J. 2001. V. 15. P.18191821.
100. LL-37, the neutrophil granule- and epithelial cell-derived cathelicidin, utilizes formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) as a receptor to chemoattract human peripheral blood neutrophils, monocytes, and T cells / D. Yang, Q. Chen, A. P. Schmidt, et al. // J. Exp. Med. 2000. V. 192. P. 1069-1074
101. Mammalian defensin in immunity: more than just microbicidal / D. Yang, A. Biragyn, L.W. Kwak, et al. // Trends in Immun. 2002. V.23, №6. P.291-296
102. Cutting edge: immature dendritic cells generated from monocytes in the presence of TGF-β1 express functional C-C chemokine receptor 6 / D. Yang, O.M. Howard, Q. ChenQ., et al. // J. Immunol. 1999. V. 163 P. 17371741.
103. Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion products of CXC chemokines / J. Krijgsveld, S.A. Zaat, J. Meeldijk, et al. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275 P. 2037420381.
104. Cutting edge: IFN-inducible ELR− CXC chemokines display defensin-like antimicrobial activity / A.M. Cole, T. Ganz T., A.M. Liese, et al. // J. Immunol. 2001. V. 167. P. 623627.
105. NMR solution structure of murine CCL20/MIP-3α, a chemokine that specifically chemoattrac