Гаврилюк Анна Мирославівна Механізми формування імунозалежного непліддя в осіб чоловічої статі з органоспецифічними та системними аутоімунними хворобами

Краткое описание

Гаврилюк Анна Мирославівна, доцент Львівського на­ціонального медичного університету імені Данила Галицько­го: «Механізми формування імунозалежного непліддя в осіб чоловічої статі з органоспецифічними та системними аутоімунними хворобами» (03.00.09 - імунологія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Та­раса Шевченка

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО
На правах рукопису
Гаврилюк
Анна Мирославівна
УДК 616.697-02:616-092.19
МЕХАНІЗМИ ФОРМУВАННЯ ІМУНОЗАЛЕЖНОГО НЕПЛІДДЯ В
ОСІБ ЧОЛОВІЧОЇ СТАТІ З ОРГАНОСПЕЦИФІЧНИМИ ТА
СИСТЕМНИМИ АУТОІМУННИМИ ХВОРОБАМИ
03.00.09 – імунологія
Дисертація
на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук
Науковий консультант
Чоп’як Валентина Володимирівна
доктор медичних наук, професор
Львів – 2017
2
ЗМІСТ
стор.
Перелік умовних скорочень 5
Вступ 12
Розділ 1. Огляд літератури 23
1.1 Імунорегуляція чоловічої фертильної функції в нормі та при
патології
23
1.2 Імуногенетичні фактори чоловічого непліддя при вродженій
патології статевих органів
33
1.3 Антиспермальні антитіла та їх вплив на фертильність
чоловіка
43
1.4 Імунопатогенетичні фактори первинної та вторинної
тестикулярної дисфункції та основні експериментальні моделі
для їх дослідження
48
1.5 Вплив системної аутоімунної патології на чоловічу
фертильність
57
1.6 Імунологічні та біохімічні маркери у діагностиці чоловічого
непліддя
70
Резюме до розділу 1. 76
Розділ 2. Матеріали і методи обстеження 81
2.1 Моделювання колаген-індукованого артриту в щурів 81
2.2 Характеристика білкового складу сироватки крові щурів із
колаген-індукованим артритом
83
2.3 Дослідження біохімічних показників крові дослідних тварин 83
2.4 Гістологічні та імуногістохімічні дослідження у щурів із СІА
2.5 Методи клінічного, інстурментального та загальноклінічного
87
3
лабораторного обстеження хворих 88
2.6 Імунологічні методи 96
2.7 Імуногенетичний аналіз 99
2.8 Статистичні методи 100
Розділ 3. Патологічні зміни у репродуктивних органах щурів з
експериментальним аутоімунним артритом
102
3.1 Оксидаційний та нітрозаційний стрес у структурі системного
запалення у тварин з колаген-індукованим артритом
105
3.2 Морфологічні характеристики тканин тварин з колагеніндукованим артритом
119
3.3. Маркери апоптозу в тканинах яєчок та придатків тварин з
колаген- індукованим артритом
128
Резюме до розділу 3 134
Розділ 4. Антиспермальний антитілогенез у хлопчиків при
патології аутоімунного генезу
138
4.1 Антиспермальне антитілоутворення в хлопчиків із
крипторхізмом та ювенільним ідіопатичним артритом
138
4.2. Імуногенетичні маркери, асоційовані з антиспермальним
антитілоутворенням у хлопчиків з крипторхізмом
147
4.3 Імунна реактивність у хворих на варікоцелє (в динаміці
хірургічного лікування)
153
Резюме до розділу 4 161
Розділ 5. Аутоантитілогенез у чоловіків з різними формами
імунозалежного непліддя
166
4
5.1 Антиспермальні антитіла в дорослих чоловіків з різними
причинами непліддя
166
5.2 Аутоантитілогенез у дорослих неплідних чоловіків з різною
супутньою патологією
172
Резюме до розділу 5 181
Розділ 6. Лімфоцитарно-цитокінові асоціації та оксидаційний
статус у неплідних чоловіків з різною супутньою патологією
186
6.1 Популяційний склад та активаційні маркери циркулюючих
лімфоцитів у неплідних чоловіків з різною супутньою
патологією
187
6.2 Цитокіновий профіль у крові та сім’яній рідині дорослих
неплідних чоловіків з різною супутньою патологією
197
6.3 Оксидаційний стрес у неплідних чоловіків з різною
супутньою патологією
214
Резюме до розділу 6 223
Розділ 7. Характеристика взаємозалежності порушень локальної
і системної імунної реактивності з непліддям у чоловіків
226
Розділ 8. Аналіз і узагальнення результатів дослідження 237
Висновки 266
Практичні рекомендації 269
Список використаних джерел 271
Додатки 309
5
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
AСАТ антиспермальні антитіла
АС анкілозивний спондилоартрит
АФК активні форми кисню
АФА активні форми азоту
IЛ інтерлейкіни
ІФН – γ інтерферон – гамма
ІФА імуноферментний аналіз
ОА олігоартрит
РФ ревматоїдний фактор
РА ревматоїдний артрит
САМ синдром активації макрофагів
СЗСТ системні захворювання сполучної тканини
СЧВ системний червоний вовчак
ТФР-α, β трансформівний фактор росту альфа, бета
ФНП-α,β фактор некрозу пухлин α,β; tumor necrosis factors α,β
ЮІА ювенільний ідіопатичний артрит
ЮРА ювенільний ревматоїдний артрит
ANA antinuclear antibodies, антинуклеарні антитіла
ANA dsDNA
antinuclear antibodies against double strain DNA,
антинуклеарні антитіла до дволанцюгової ДНК
ANA ssDNA antinuclear antibodies against single strain DNA,
6
антинуклеарні антитіла до одноланцюгової ДНК
ANA RNP
antinuclear antibodies against Ribosomal Nuclear Protein,
антинуклеарні антитіла до рибосомального
нуклеарного протеїну
ANA Sm
antibodies against nuclear Smith-antigen, антитіла до
антигену Сміта
ANA Scl 70
antibodies against nuclear antigen Scl 70, антитіла до
нуклеарного антигену Scl 70
ANA SS-A
(Ro)
antibodies against complex RNA-proteins, антитіла до
комплексу РНК-протеїни
ANA SS-B
(La)
antibodies against complex RNA-phosphoproteins,
антитіла до комплексу РНК-фосфоліпіди
ANA Jo-1
antibodies against antigen Jo-1,
антитіла до антигену Jo-1
АNCA
anti-neutrophil cytoplasm antibodies,
антинейтрофільноплазматичні антитіла
ANCA -PR-3
anti-neutrophil cytoplasm antibodies against proteinase –
3, антинейтрофільноплазматичні антитіла до
протеїнази-3
ANCA –MPO
anti-neutrophil cytoplasm antibodies against
mieloperoxydase, антинейтрофільноплазматичні
антитіла до мієлопероксидази
АPL antiphospholipid antibodies, антифосфоліпідні антитіла
7
APC antigen presenting cell, антигенпрезентувальна клітина
Bcl -2
apoptosis-regulated protein, білок, який регулює процес
апоптозу
Вах proapoptotic protein, проапоптичний білок
C сomplement, комплемент
СІА collagen-induced arthritis, колаген-індукований артрит
3΄5΄-cGMP
3΄5΄- cyclic guanosine monophosphate, 3΄5΄-
циклічний гуанозинмонофосфат
CD cluster of differentation, кластер диференціації
CP
cysteinyl aspartate-specyfic proteinases, цистеїнові
аспартат-специфічні протеази (каспази)
C1qR
C1q complement receptor, рецептор до
компоненту комплементу C1q
CTLA-4
cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4, антиген-4,
асоційований із цитотоксичним Т-лімфоцитом
DAMP
danger associated molecular patterns, асоційовані із
небезпекою молекулярні патерни
DAP12
death-adaptor protein 12, білок адаптор 12, залучений в
активації апоптозу
DC dendritic cell, дендритна клітина
DED
death effector domain, ефекторний домен клітинної
загибелі
8
DNA dezoxirybonucleoprotein acid, дезоксирибонуклеопротеїнова кислота
ЕАО
experimental autoimmune orchitis,
експериментальний аутоімунний орхіт
FA-1 fertilizing antigen, фертилізуючий антиген
FADD
Fas-associated death domain, Fas-асоційований домен
клітинної загибелі
Fas(CD 95
/Apo-1)
integrated membrane protein / receptor to TNF-family,
інтегрований у мембрану білок / рецептор родини
TNF
FasL (CD)
178/Apo-1L)
apoptosis induced integrated membrane protein,
інтегрований у мембрану білок, індукований
апоптозом
FSH
follicle stimulating hormone, фолікулостимулювальний
гормон
Foxp3 transcription factor of Treg, транскрипційний фактор Tрегуляторних лімфоцитів
G-CSF granulocyte colony-stimulating factor, гранулоцитарний
колонієстимулювальний фактор
GM-CSF
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,
гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулювальний фактор
gp glycoprotein, глікопротеїн
GPI (PD) glycozylophosphatidylinositol, глікозильований
9
фосфатидилінозитол (фосфатидилінозитол)
HLA
human leukocyte antigens, лейкоцитарні антигени
людини
HLA – A,B,C
human leukocyte antigens of sublocus A, B, C,
лейкоцитарні антигени людини сублокусів A, B, C
HLA-DR
human leukocyte antigens of sublocus D, лейкоцитарні
антигени людини сублокусу D
HSP heat-shock protein, білки теплового шоку
IBT immuno-bead test, тест з поліакриламідними кульками
ICSI intracytoplasmic sperm injection, інтрацитоплазматична
ін’єкція сперматозоїда (у яйцеклітину)
IVF in vitro fertilization, запліднення in vitro
IgG, A, M immunoglobulins of classes G, A, M імуноглобуліни
ізотипів G, A, M
IFN - α,β,γ interferons α,β,γ, інтерферони - α,β,γ
IL-1 (1, 2…) interleukins (1, 2…), інтерлейкіни (1, 2…)
IL-1Ra IL-1-receptor antagonist, антагоніст рецептора IL-1
ІTAM immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,
активаторний імунорецепторний тирозиновий мотив
ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs,
інгібіторний імунорецепторний тирозиновий мотив
JAM-A junctional adhesion molecule, синаптична адгезивна
молекула
KIR killer cell inhibitory / immunoglobulin like receptor,
10
інгібіторний імуноглобулінподібний рецептор
кілерних клітин
KIR-DL
long domain of killer cell inhibitory / immunoglobulin
like receptor, довгий домен інгібіторного /
імуноглобулінподібного рецептора кілерних клітин
KIR-DS
short domain of killer cell inhibitory / immunoglobulin
like receptor короткий домен інгібіторного /
імуноглобулінподібного рецептора кілерних клітин
LH luteising hormone, лютеїнізувальний гормон
LPS lipopolysacharide, ліпополісахарид
MAR
mixed antiglobulin reaction, змішана антиглобулінова
реакція
MCP (CD 46) membrane cofactor protein, мембранний білок-кофактор
M-CSF macrophage colony-stimulating factor, макрофагальний
колонієстимулювальний фактор
MHC major histocompability complex, головний комплекс
гітосумісності
MICA, MICB
nonclassic molecules of HLA classe I, некласичні
молекули класу І системи HLA
MIF
macrophage migration inhibitory factor, фактор
інгібування міграції макрофагів
MMP-3 metalloproteinase – 3, металопротеїназа – 3
NF-κB nuclear factor κB, ядерний транскрипційний фактор κB
NK G2D NK- cell receptors, рецептори на НK- клітині
11
NO nitric oxide, оксид нітрогену
NOS nitric oxide syntase, синтаза оксиду нітрогену
PCR polymerase chain reaction, ланцюгова полімеразна
реакція
PD-L1 programmed death ligand-1, ліганд-1 програмованої
загибелі
PH-20, 30 phertyline -20, 30; фертилін 20, 30
PRR рattern recognition receptors; патерн-розпізнавальні
рецептори
RNA rybonucleoprotein acid, рибонуклеопротеїнова кислота
RP relapsing polychondritis, рецидивуючий поліхондрит
SAGA-1 (CD
52)
spermatozoa-agglutinating antigen-1, антиген – 1, що
аглютинує сперматозоїди
TCR Т-cell receptor, Т – клітинний рецептор
Tregs Т-regulatory lymphocytes, Т – регуляторні лімфоцити
TNFR TNF-α receptor, рецептор до TNF-α
TLR -TIR domens of Toll-like receptors, домени Toll-подібних
рецепторів
TRAIL TNF-related apoptosis inducing ligand, TNF-залежний
ліганд, що індукує апоптоз
YLR-12
Y-chromosome determined sperm membrane protein-12,
детермінований Y-хромосомою протеїн – 12 мембрани
сперматозоїда
YRPM RNA-recognition motif of Y-chromosome, РНК –
розпізнавальний мотив Y-хромосоми
12
ВСТУП
Стан репродуктивної системи людини є одним із важливих показників
стану здоров'я. При його частоті від 10-15% до 18 – 20% можна стверджувати
про прямі репродуктивні втрати у людській популяції [350]. В світі частота
жіночого непліддя складає 30%, чоловічого – 30%, поєднаного, або
родинного – 30% та неясного походження – 10% [10, 11, 146, 147, 148]. В
Україні структура непліддя дещо інша – у 79,4% неплідних пар причинним
вважається «жіночий фактор», а у 20,6% - «чоловічий фактор». В Україні на
непліддя страждає близько 1 млн подружніх пар, тобто 15-17% [16, 21], це є
відображенням стану здоров'я популяції та загрожує демографічною
катастрофою [39]. За останні роки у три рази зросла кількість випадків
чоловічого непліддя, виявленого вперше [21]. Зазначене вище обумовлює
необхідність покращення діагностики цієї патології, забезпечення повноти
реєстрації таких пацієнтів та впровадження профілактичних заходів
попередження захворювання [15].
Репродуктивне здоров'я залежить від багатьох чинників соматичного,
психологічного та соціального характеру [10, 20, 159]. Основними
причинами жіночого та чоловічого непліддя є: генетичні [3, 4, 63, 306];
імуногенетичні [152]; вади розвитку статевих органів [12]; гормональні
розлади [258]; інфекції, що передаються статевим шляхом [8, 114]; імунні
порушення [179], алергопатологія [37]; психоемоційні розлади [17].
Механізми формування чоловічого непліддя дедалі частіше
виявляються імунозалежними. Розвиток імунозалежного чоловічого
непліддя в основному ґрунтується на різних порушеннях вродженого та
набутого імунітету, основними чинниками реалізації якого є антитіла проти
спермальних антигенів (АСАТ) [63].
Формування нового погляду на чоловіче непліддя як імунозалежний
процес проходить з певними труднощами, відбувається перегляд
13
стереотипних уявлень про його патогенез. Раніше вважали, що патологічна
імунна відповідь розвивається до антигенів тканин яєчок, придатків чи
комплексу додаткових залоз (зокрема, простати). Тепер доведено, що одним
із найважливіших патогномонічних факторів у розвитку непліддя є антигени
сперматозоїдів [214]. Імунні комплекси антиспермальних антитіл зі
сперматозоїдами здатні активувати метаболічні процеси в сперматозоїді,
стимулювати продукцію вільних кисневих радикалів, порушувати
акросомальну реакцію та пошкоджувати клітину, впливати на розвиток
зародка [41, 42, 43]. Активація антиспермального антитілогенезу
відбувається у випадку вроджених структурних вад яєчок як прояв
органоспецифічного імунітету, і найчастіше спостерігається у
препубертатному та ранньому пубертатному періодах внаслідок порушення
гемато-тестикулярного бар'єру та інфекційних процесів [242]. У дорослих
чоловіків продукцію АСАТ можна назвати нерозгаданим імунологічним
феноменом [235]. Характер тригеру (системний чи локальний)
антиспермального антитілогенезу у дорослих чоловіків невідомий. З огляду
на це актуальним є поглиблене вивчення походження, ізотипу, сайтів
зв'язування АСАТ, особливостей реалізації антитілозалежної
цитотоксичності, яка є одним із доведених імунозалежних механізмів
чоловічого непліддя [81].
Найважливішою ланкою в чоловічій репродуктивній функції є якість
процесу сперматогенезу. На нього впливають такі фактори: аплазія
зародкових клітин сперматогенного епітелію; природжена патологія
статевих органів – ретенція яєчок; аплазія (агенезія) гонад; варікоцелє;
імунні, генетичні та нейрогенні порушення [121, 190]. Надзвичайно важливу
роль у порушенні процесів сперматогенезу відіграє запальна реакція імунної
системи. Саме запальні процеси в яєчках, оксидаційний та нітрозативний
стреси, які їх супроводжують, а не інфекційні чинники, є найбільш
небезпечними для сперматогенезу [179, 247]. Розвиток запального процесу
14
асоційований зі зміною локального і системного цитокінового профілю в
організмі [4, 57, 70, 377]. Вплив цитокінів на репродуктивну функцію
чоловіка значною мірою визначається місцем їх продукції (периферична
кров, сім'яна рідина, тканина яєчка) [8, 11]. Підвищені рівні прозапальних
цитокінів асоціюються із запальними процесами у чоловічій статевій системі,
оксидативним стресом та апоптозом гермінативних клітин.
Запалення у яєчках асоційоване із лейкоцитоспермією, підвищенням
рівнів вільних кисневих радикалів, оксидаційним стресом, які негативно
впливають на сперматозоїди, знижуючи фертильність чоловіків. Клітинні
імунні реакції та їх кореляційний взаємозв'язок із зазначеними гуморальними
чинниками запальної реакції в умовах розвитку чоловічого непліддя
представляють значний інтерес для розшифрування імунопатогенетичних
механізмів цієї патології і практично не досліджені. Залишаються до
сьогоднішнього дня невідомими і тригерні чинники локальної запальної
реакції імунної системи у яєчках. Одним з гіпотетичних пускових чинників
локального запалення, асоційованого з розвитком непліддя у чоловіків, є
аутоімунні захворювання.
Системні захворювання сполучної тканини (СЗСТ), у першу чергу
ревматоїдний артрит (РА) та системний червоний вовчак (СЧВ), є
аутоімунними хворобами. Аутоімунні хвороби – це патологічний процес, у
патогенезі яких важливу роль відіграють аутоантитіла та/або клітинна
аутоімунна відповідь. З нечисленних літературних даних відомо, що СЗСТ
чинять негативний вплив на фертильність чоловіка. Проблема торкається
також і дітей. Раннє формування системної аутоімунної хвороби у хлопчиків
загрожує ускладненнями розвитку їх репродуктивної функції [290].
На сьогоднішній день розглядаються наступні гіпотетичні патогенетичні
механізми взаємозв'язку аутоімунної патології з розвитком чоловічого
непліддя: 1) відміна активної толерантності до сперматозоїдів; 2) зміна
хімічної структури спермальних антигенів та антитіл до них під впливом
15
гострого, хронічного чи латентного перебігу запального процесу; 3) вплив
локального та системного оксидаційного стресу; 3) «молекулярна мімікрія»
як причина продукції АСАТ; 4) зміни апоптозу статевих клітин (незрілих чи
дефективних), утворення неоаутоантигенів і синтез АСАТ до них [235].
Аналіз сучасних експериментальних і клінічних даних засвідчує, що для
раціональної терапії чоловічого непліддя необхідні нові
фармакотерапевтичні підходи та розширення арсеналу відповідних
лікарських засобів, що потребує глибокого знання усіх аспектів патогенезу
цієї патології [5]. Виявлення імунозалежних механізмів формування непліддя
у пацієнтів з аутоімунними хворобами допоможе вирішити цю проблему.
Для більш точного визначення частки «чоловічого фактору» у
родинному неплідді потрібно покращити його діагностику, розробивши її
сучасний алгоритм. Зважаючи на доведену участь у патогенезі чоловічого
непліддя системних та локальних порушень в імунній системі, детальний
аналіз характеру, відмітних особливостей та механізмів цих порушень
сприятиме пошуку нових діагностичних маркерів, необхідних для раннього
виявлення, визначення ступеню ризику розвитку і профілактики цієї
патології, а також може стати запорукою ефективної стратегії лікування, у
тому числі й імунотерапевтичної.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна роботу виконувалася в межах науково-дослідної роботи
кафедри клінічної імунології та алергології Львівського національного
медичного університету імені Данила Галицького за темою „Оцінка
взаємозв'язку імунологічних, генетичних, гормональних механізмів розвитку
вторинних системних васкулітів та поліімунопатології за умов системних
захворювань сполучної тканини та оцінка ефективності та безпеки
застосування терапії супроводу біофлавоноїдів та бігуаноїдів” (державна
реєстрація №0112U000166).
16
Мета та завдання дослідження. Метою роботи було дослідити
імунозалежні механізми непліддя в експерименті у самців щурів та пацієнтів
чоловічої статі з аутоімунними захворюваннями та іншою супутньою
патологією, розробити алгоритм його діагностики у досліджуваних групах.
Для досягнення поставленої мети було сформульовано наступні
завдання:
1. У експерименті на тваринах з індукованим системним аутоімунним
захворюванням оцінити гістологічні характеристики органів
репродуктивного тракту та показники локальної і системної імунної
реактивності.
2. Дослідити імуногенетичні показники (HLA-антигени, KIR-рецептори)
як можливі фактори ризику порушень репродуктивної функції у
хлопчиків з крипторхізмом.
3. Дослідити характеристики антиспермальних антитіл у сироватці крові
хлопчиків з крипторхізмом та ЮІА та у неплідних чоловіків з
аутоімунною та іншою супутньою патологією.
4. Визначити вміст маркерних для системної аутоімунної патології
аутоантитіл у неплідних чоловіків з аутоімунною та іншою супутньою
патологією.
5. Провести визначення кількісних показників лімфоцитів основних
популяцій та субпопуляцій, а також їх активаційних маркерів у
неплідних чоловіків з аутоімунною та іншою супутньою патологією.
6. Визначити рівні цитокінів у неплідних чоловіків з аутоімунною та
іншою супутньою патологією та оцінити взаємозв’язок між ними.
7. Розробити алгоритм лабораторних обстежень чоловіків з непліддям
імунозалежного ґенезу.
Об’єкт дослідження – імунні, імуногенетичні та біохімічні процеси
формування непліддя у осіб чоловічої статті в експерименті та клініці.
17
Предмет дослідження – особливості оксидаційної та антиоксидаційної
систем та апоптозу гермінативних клітин тварин з індукованим системним
аутоімунним захворюванням, стану місцевого та системного імунітету у
пацієнтів чоловічої статі з аутоімунною та іншою супутньою патологією.
Методи дослідження. У роботі використано біохімічні (визначення
вмісту продуктів оксидаційних реакцій, встановлення рівня активності
індикаторних ензимів та продуктів їх реакції в сироватці крові), цитологічні
(проточна цитофлуориметрія), фізико-хімічні (електрофорез),
нефелометричний (імунохімічний аналіз), імуноферментні, морфологічні
(гістологічне дослідження зрізів тканин), імуногістохімічні, статистичні
методи.
Наукова новизна одержаних результатів. Розширено існуючі
уявлення про причини, які можуть стати підставою для запуску аутоімунної
реакції, та провідні імунозалежні механізми формування непліддя в осіб
чоловічої статі із аутоімунними хворобами та іншою супутньою патологією.
У експерименті на тваринах з індукованим системним захворюванням
(колагеновий артрит) уперше виявлено, що механізми імунозалежного
пошкодження плідної функції ґрунтуються на факторах вродженого
імунітету – посиленні синтезу клітинами імунної системи реактивних форм
кисню та азоту, наслідком дії яких є підвищення рівня апоптозу
сперматогенних клітин.
Отримано нові дані про взаємозв’язок імунозалежного чоловічого
непліддя з наявністю антиспермальних антитіл, змінами рівнів прозапальних
цитокінів ІЛ-1β, ІЛ-6, ІЛ-18, ІФН-γ, числом CD4+, CD8+, CD4+/25+ клітин,
збільшення відносного числа лейкоцитів з експресією активаційного маркера
(HLA-DR+), порушенням показників оксидаційного та нітрозаційного стресу і,
як наслідок, посиленням апоптозу гермінативних клітин. Вперше виявлено
кореляційні зв'язки між рівнями цитокінів ІЛ-6, 10, 18, ІФН-γ, ФНП-α та
числом CD8+, CD16+/56+, CD4+25+ клітин в крові, кількістю сперматозоїдів,
18
їх рухливістю, відсотком дегенеративних форм, лейкоцитоспермією та
рівнем антиспермальних антитіл. У хворих із крипторхізмом уперше вивчені
імуногенетичні маркери синтезу органоспецифічних антиспермальних
антитіл: HLA-DRB1*08 та активаторних KIR-рецепторів (KIR-2DS5) на НКклітинах, що дає підстави вважати цю хворобу за патогенезом
органоспецифічним аутоімунним захворюванням.
На підставі вивчення семіологічних та імунологічних показників
підтверджено наявність імунопатологічних змін у неплідних пацієнтів із
варікоцелє, системними захворюваннями сполучної тканини, та соматично
здорових чоловіків. дружини яких мали 2-3 ранніх викидні, а також уперше
виявлено наявність імунопатологічних змін у пацієнтів з ідіопатичним
непліддям. Отримано нові дані про наявність АСАТ у хлопчиків із
імунозалежними захворюваннями (крипторхізм, ЮІА). Уперше виявлено та
охарактеризовано ізотиповий склад АСАТ та сайти їх зв'язування за умов
розвитку системної аутоімунної патології (ЮІА) у дитячому віці, які можуть
складати ризик формування непліддя у дорослому віці.
Практичне значення одержаних результатів. За результатами
дисертаційної роботи розроблено алгоритм комплексного лабораторного
дослідження показників імунної системи для диференційної діагностики
імунозалежного непліддя у осіб чоловічої статі на тлі аутоімунної та іншої
супутньої патології. На основі розробленого алгоритму сформульовані
практичні рекомендації. Результати роботи впроваджено в навчальний
процес на кафедрах клінічної імунології та алергології, дитячої хірургії,
ортопедії та травматології, урології, патологічної анатомії Львівського
національного медичного університету імені Данила Галицького,
використовуються у діагностично-лікувальному процесі медичних закладів
міст Львова, Івано-Франківська, Чернівців.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним
науковим дослідженням. Автором було складено план проведення
19
досліджень і підібрано оптимальні методичні підходи до реалізації
поставлених завдань. Аналіз та інтерпретація одержаних результатів,
викладення висновків дисертаційної роботи обговорювалися з науковим
консультантом, д.мед.н., проф. Чоп’як В.В. Дисертантом не було
використано ідей співавторів публікацій. Експериментальну частину
дисертаційної роботи виконано самостійно на кафедрі клінічної імунології та
алергології ЛНМУ імені Данила Галицького і у співпраці із завідувачем
лабораторії молекулярних механізмів міжклітинної взаємодії Відділу
регуляції проліферації клітин і апоптозу Інституту біології клітини НАН
України д.б.н. проф. Ю. Я. Котом (м. Львів, Україна). Дослідження активних
форм кисню та азоту виконувалося в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця
НАН України (м. Київ, Україна).
Визначення антиспермальних антитіл у сироватці крові та сім’яній
рідині непрямим IDIBT (indirect immunobead test) методом виконано у
дорослих чоловіків самостійно в імунологічній лабораторії Регіонального
центру клінічної імунології та алергології (м. Львів, Україна) та спільно із
науковим співробітником відділу імунобіології репродукції Інституту
генетики людини м. Познань (Польща) доктором Маженою Камєнічною
(хлопчики з крипторхізмом). Типування HLA-антигенів II-го класу у
хлопчиків з крипторхізмом виконано самостійно (ізоляція ДНК) та спільно з
науковим співробітником лабораторії тканинного типування Інституту
експериментальної імунології та терапії м. Вроцлав (Польща) доктором
Беатою Новаковською.
Типування KIR-рецепторів та їх епітопів виконано самостійно (ізоляція
ДНК) та спільно з науковим співробітником лабораторії тканинного
типування Інституту експериментальної імунології та терапії (м. Вроцлав,
Польща) доктором Вандою Нєпєкло-Мінєвською. Морфологічне
дослідження та опис гістологічних зрізів експериментальних тварин
виконано спільно із доцентом кафедри патологічної анатомії ЛНМУ ім.
20
Данила Галицького В. І. Вовком. Імуногістохімічне дослідження зрізів
тканин експериментальних тварин та їх опис виконані спільно із завідувачем
патоморфологічної лабораторії діагностично-консультативного центру „CSD
Health care” к.мед.н О. О. Селезньовим (м. Київ, Україна). Спільно із
доцентом кафедри організації охорони здоров'я ЛНМУ ім. Данила
Галицького Т. Г. Гутором проведено статистичну обробку результатів
дослідження. Самостійно проаналізовано і узагальнено отримані результати,
написано усі розділи дисертації.
Автором підготовано результати роботи до друку та оприлюднення на
національних та міжнародних форумах.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були
представлені на: науково-практичній конференції з міжнародною участю
«Імунологія репродукції» (Львів, Україна, 2006); 9-ій конференції
«Молекулярна біологія в діагностиці інфекційних хвороб та біотехнології»
(Варшава, Польща, 2006); науково-практичному семінарі з міжнародною
участю «Діагностика та імунотерапія імунозалежного непліддя чоловіків та
жінок» (Черкаси, Україна, 2008); 13-му з’їзді Польського Товариства
клінічної та експериментальної імунології (Краків, Польща, 2008);
міжнародній науково-практичній конференції «Імунотерапія,
імунопрофілактика в клінічній практиці: реалії та перспективи» (Львів,
Україна, 2009); курсі лекцій в Університетській клініці Одеського
національного медичного університету «Імунологічні аспекти
інфертильності» (Одеса, Україна, 2010 року); міжнародній науковопрактичній конференції «Імунотерапія, імунопрофілактика: реалії та
перспективи» (Львів, Україна, 2010); науково-практичній конференції з
міжнародною участю «Імуногенетика та репродуктивні втрати» Львів,
Україна, 2010); симпозіумі фахівців України з репродуктивної медицини
(Харків, Україна, 2011); 9-му європейському конгресі з імунології
репродукції (Копенгаген, Данія, 2011); 14-му з'їзді Польського Товариства
21
клінічної та експериментальної імунології (Гданськ, Польща, 2011);
міжнародній науково-практичній конференції «Імунопрофілактика – нові
підходи» (Київ, Україна, 2012); VI-му Національному конгресі патофізіологів
України з міжнародною участю (Сімферополь-Місхор, Україна, 2012);
об’єднаному міжнародному конгресі Американського Товариства імунології
репродукції та Європейського товариства імунології репродукції (Гамбург,
ФРН, 2012); І-му Всеукраїнському конгресі «Молекулярна алергологія та
імунологія» (Одеса, Україна. 2013); науково-практичній конференції
«Актуальні питання лабораторної діагностики в акушерстві та гінекології»
(Львів, Україна, 2013); науково-практичній конференції з міжнародною
участю «Актуальні питання ендокринології, клінічної імунології та
алергології» (Чернівці, Україна, 2013); науково-практичній конференції з
міжнародною участю «Репродуктивне здоров'я: актуальні питання
сьогодення» (Київ, Україна, 2013); міжнародній науково-практичній
конференції «Нові стратегії в діагностиці та лікуванні алергічних,
аутоімунних, імунодефіцитних захворювань» (Трускавець, Україна, 2014);
другій науково-практичній конференції з міжнародною участю «Гармонія
гормонів – основа здоров’я жінки» (Київ, Україна, 2014); 11-му конгресі
Європейського та Угорського Товариств імунології репродукції (Будапешт,
Угорщина, 2014); 15-му з’їзді Польського Товариства клінічної та
експериментальної імунології (Вроцлав. Польща, 2014); 15-му ювілейному
з’їзді Товариства польських дитячих хірургів (Гданськ. Польща, 2014);
міжнародному симпозіумі «Урологія майбутнього» (м. Кам'янецьПодільський, Україна, 2015); 13-му конгресі Міжнародного та Європейського
товариств імунології репродукції (Ерфурт, Німеччина, 2016); науковопрактичній конференції з міжнародною участю «Патологія слизових
оболонок у жінок: роль мікробіоти» (Київ. Україна. 2016).
Публікації. Основні результати дослідження та положення дисертації
опубліковані у 107-ми публікаціях: розділах 7-ми підручників та монографій;
22
63 наукових статтях, із яких 27 – у провідних фахових виданнях, що входять
до переліку, затвердженого ДАК України; 30 тезах у матеріалах з’їздів,
конференцій, конгресів, симпозіумів; двох патентах на корисну модель; двох
винаходах та двох інформаційних листах. За кордоном опубліковано: три
розділи у монографіях (два – англійською, один – польською), 11 статей (10 –
англійською, 1 – польською) та 16 тез (англійською мовою) .
Структура та обсяг дисертації. Текст дисертації викладений на 308
сторінках машинописного тексту (основна частина – 270 сторінки),
ілюстрований: 33 таблиці, 50 рисунків. Дисертація складається зі вступу,
аналітичного огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, семи
розділів результатів власних досліджень, аналізу й узагальнень результатів
дослідження, висновків і практичних рекомендацій, восьми додатків. Перелік
використаних літературних джерел містить 382 назв, із них 25 назв робіт
вітчизняних авторів і 357 – зарубіжних авторів.

Список литературы

ВИСНОВКИ
Функціонування імунної і репродуктивної систем чоловічого організму є
тісно пов'язаним і заємозалежним. Розлади імунної реактивності, котрі
супроводжують розвиток аутоімунної патології в експерименті та клініці,
асоційовані з порушеннями репродуктивної функції у чоловіків. Однак,
характер патологічних змін імунної системи, пов'язаний з розвитком непліддя у
чоловіків на тлі аутоімунної та іншої супутньої патології, залишається
недостатньо дослідженим.
У дисертаційній роботі вирішено актуальну проблему імунології
репродукції – визначення механізмів розвитку імунозалежного непліддя в
експерименті та клініці за умов аутоімунної патології та інших супутніх
захворювань. Встановлено основні імунозалежні чинники, які впливають на
формування чоловічого непліддя імунного генезу.
1. Розвиток колаген-індукованого артриту в щурів супроводжується
значним посиленням експресії ліганду Fas та каспази-3 у зародкових
клітинах з розвитком локальної запальної реакції, посиленої інфільтрації
яєчок імуноцитами та системною запальною реакцією з підвищенням
активності лужної фосфатази у 1,8 разів, аланінамінотрансферази – у 2
рази, сироваткового рівня активних форм кисню та азоту – у 2,5 та 2 рази
відповідно.
2. Виявлена присутність антигену HLA-DRB1*07,08 та експресія рецептора
KIR-2DS5, які асоціюються із наявністю у крові хлопчиків з
крипторхізмом АСАТ (R=0,52). У 30% хлопчиків із крипторхізмом у
сироватці крові виявлені АСАТ ізотипів ІgA (57,6%) і ІgM (54,6%), сайти
їх зв’язування були переважно розташовані на кінчику хвостика
сперматозоїда (81,8%). Не було відзначено різниці у характеристиках
АСАТ залежно від форми крипторхізму – однобічного або двобічного, а
також віку.
267
3. У 34,7% хлопчиків, хворих на ентезит-асоційовану форму ювенільного
ідіопатичного артриту, у сироватці крові виявлено антиспермальні
антитіла ізотипу ІgМ (52,9%) із сайтом прикріплення Тt (82,4%).
4. Встановлено, що серед неплідних чоловіків найбільша кількість осіб з
присутніми у сім’яній рідині АСАТ належала до чоловіків, дружини яких
мали ранні викидні (37,5%), та пацієнтів з ідіопатичним непліддям (30,8%)
Усі АСАТ в сім’яній рідині мали сайт прикріплення на хвостику
сперматозоїдів і були ізотипу IgA у 66,0% випадків.
5. Показано, що у неплідних пацієнтів з СЗСТ характерним є підвищення у
сироватці крові антифосфоліпідних аутоантитіл ізотипу IgM - у 4,0 рази,
IgG - у 5,0 разів, аутоантитіл до β2-GP 1 IgM - у 5,0 разів, IgG - у 4,0 рази,
аутоантитіл до МРО ізотипу IgG – у 8,0 разів; з ідіопатичним непліддям -
антифосфоліпідних аутоантитіл ізотипів IgM та IgG - у 2,0 рази,
аутоантитіл до β2-GP 1 ізотипу IgM - у 3,8 разів, ізотипу IgG - у 1,5 разів,
аутоантитіл до МРО ізотипу IgG – у 2 рази; чоловіків, дружини котрих
мали ранні викидні - антифосфоліпідних аутоантитіл ізотипу IgM - у 6,0
разів, ізотипу IgG - у 8,0 разів, антитіл до β2-GP 1 ізотипів IgM та IgG - у
7,0 разів, аутоантитіл до МРО ізотипу IgG - у 5,8 разів.
6. Визначено, що для неплідних пацієнтів з хронічними запальними
хворобами характерною була підвищена відносна кількість CD8+ клітин -
у 1,2 разів, CD4+25+ клітин - у 1,5 разів та знижена кількість CD16/56+
клітин - у 1,5 разів; для чоловіків з ідіопатичним непліддям – підвищена
кількість CD4+ лімфоцитів - у 1,2 разів та CD4+25+ лімфоцитів - у 1,6 разів;
для чоловіків, дружини котрих мали 2-3 ранніх викидні, підвищена - у 1,2
разів кількість CD8+ Т-лімфоцитів. У чоловіків з аутоімунними
захворюваннями кількість CD4+CD25+-лімфоцитів є предиктором
зниження рухливості сперматозоїдів.
7. Визначено, що у сироватці крові хворих з варікоцелє, СЗСТ, ідіопатичним
непліддям та у чоловіків, дружини котрих мали ранні викидні, рівень
ІФН-γ був підвищений у середньому в 2,7 разів, у чоловіків із СЗСТ та
268
ідіопатичним непліддям рівень ІЛ-6 був підвищеним у 5,3 рази, ІЛ-18 –
1,5 разів, у чоловіків із хронічними запальними хворобами виявлено
зниження рівня ІЛ-1β у 3,36 рази та ТФР-β1 у 2, 42 рази.
8. Показано, що у сім'яній рідині чоловіків із варікоцелє, СЗСТ, хронічними
запальними хворобами та у чоловіків, дружини яких мали ранні викидні,
є підвищені рівні ІЛ-6 в середньому в 2,5 разів, ІЛ-18 - у 2,3 рази , ФНП-α
- у 2,3 рази та знижені рівні ІЛ-1β - у 2,3 рази та ТФР-β1 - у 1,3 рази, у
пацієнтів з хронічними запальними хворобами були знижені рівень ІЛ-1β
- у 2,7 рази та ТФР-β1 - у 1,2 рази та підвищені рівні ІЛ-6 - у 2,5 разів та
ІЛ-18 - у 3 рази.
9. Визначено, що у хворих на СЗСТ діагностичним алгоритмом
прогнозування ризику порушення фертильності є наступні імунологічні
зміни: підвищені рівні ІЛ-6 - у 7 разів, ІЛ-18 - у 1,5 рази, ІФН-γ - у 3,5
рази в сироватці крові; підвищені концентрації ФНП-α - у 1,2 рази, ІЛ-6,
18 - у 3,5 разів та знижений рівень ТФР-β1 та ІЛ-1β - у 2,1 рази у сім’яній
рідині; підвищена кількість у крові CD4+CD25+ Т-клітин - у 1,3 разів та
знижена CD4+CD25- Т-клітин - у 1,2 разів; підвищена кількість
сироваткових аутоантитіл до ДНК у 5,3 рази, фосфоліпідів - у 4,5 разів,
мієлопероксидази - у 8,0 разів; підвищення рівня малонового диальдегіду
у крові - у 2,25 разів, у сім'яній рідині - у 8,6 разів.