Гибридные белки на основе 10-го домена фибронектина для молекулярной диагностики и терапии Гапизов Султан Шахбанович

Краткое описание

Гапизов,СултанШахбанович.Гибридныебелкинаоснове10доменафибронектинадлямолекулярнойдиагностикиитерапии: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.08 /ГапизовСултанШахбанович; [Место защиты: Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова]. - Москва, 2019. - 142 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
Ю.А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК На правах рукописиГАПИЗОВСУЛТАНШАХБАНОВИЧГибридныебелкинаоснове10доменафибронектинадлямолекулярнойдиагностикиитерапии03.01.08 Биоинженерия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: д. б. н., профессор

стр. 4
.................................................. 107 4.3. Получениегибридныхбелковпролонгированного действия наосновеальбуминсвязывающегодомена(ABD) и αvβ3-интегрин-связывающего варианта 10Fn3. ................ 109 4.3.1 Конструирование и экспрессиягибридныхбелков................................................. 109 4.3.2. Изучение взаимодействиягибридныхбелковс альбумином ................................ 110 4.3.3....

стр. 9
свойства рекомбинантныхбелков. 1.2. Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является конструированиегибридныхбелковнаоснове10 Fn3длядиагностикиитерапиихронических воспалительных заболеваний и исследование их физико-химических и биологических свойств. Выбор данного каркасногобелкаопределяется

Оглавление диссертациикандидат наук Гапизов Султан Шахбанович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цель и задачи исследования
1.3. Научная новизна работы
1.4. Практическая значимость исследования
1.5. Основные положения, выносимые на защиту
1.6. Апробация результатов
1.7. Публикации
1.8. Личный вклад автора в проведение исследования
1.9. Структура и объем диссертации
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Молекулярные механизмы воспалительных процессов
2.1.1. Неоангиогенез и его молекулярные маркеры
2.1.1.1. Интегрины
2.1.1.2. Строение и функции УЕОБ и УЕОРЯб
2.1.1.3. Сигнальный путь УЕОБК2 и его роль в формировании сосудов
2.1.2. Роль ФНО в развитии хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваний
2.2. Стратегии молекулярной диагностики и терапии воспалительных заболеваний
2.2.1. Моноклональные антитела и их производные
2.2.2. Иммуноадгезины
2.2.3. Природные и искусственные антагонисты
2.2.4. Альтернативные каркасные белки (АКБ)
2.2.5. Проблемы, связанные с использованием АКБ, и пути их решения
2.3. Использование 10 домена фибронектина 3 типа человека (10Еп3) в качестве искусственного связывающего белка
2.3.1. Характеристика 10Бп3
2.3.2. Методы получения искусственных связывающих белков на основе 10Бп3. Стратегии селекции комбинаторных библиотек
2.3.2.1. мРНК-дисплей
2.3.2.2. ОБ-дисплей
2.3.2.3. Фаговый дисплей
2.3.2.4. Дрожжевой дисплей
2.3.2.5. Двугибридный дрожжевой дисплей
2.3.2.6. Бактериальный дисплей
2.3.3. Применение связывающих белков на основе 10Fn3 в молекулярной диагностике и терапии
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Растворы и реагенты
3.2. Методы
3.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
3.2.2. Рестрикция
3.2.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле
3.2.4. Выделение плазмидной ДНК из агарозных гелей
3.2.5. Лигирование
3.2.6. Конструирование плазмид
3.2.6. Экспрессия рекомбинантных генов
3.2.7. Трансформация
3.2.8. ПЦР-анализ клонов
3.2.9. Выделение плазмидной ДНК из E.coli
3.2.10. Выделение и анализ фракций, содержащих белки внешней мембраны
3.2.11. Селекция ФНО-связывающих вариантов 10Fn3 методом бактериального дисплея
3.2.12. Анализ эффективности селекции методом ИФА
3.2.13. Клонирование библиотеки генов 10Fn3 в вектор для прямой экспрессии
3.2.14. Анализ библиотеки клонов
3.2.15. Выделение белков
3.2.16. Аналитическая гель-фильтрация
3.2.17. Электрофорез белков в SDS-ПААГ
3.2.18. Вестерн-блот
3.2.19. Определение цитотоксической активности ФНО
3.2.20. Определение Кё комплекса 10Fn3 и ФНО
3.2.21. Цельноклеточная ELISA и измерение эстеразной активности
3.2.22. Измерение спектров флуоресценции
3.2.23. Изучение термической стабильности ABD-содержащих гибридных белков
3.2.24. Конфокальная микроскопия
3.2.25. Исследование образования комплексов между ABD-содержащими гибридными белками и HSA
3.2.26. Исследование времени циркуляции гибридных белков в кровотоке мышей
3.2.27. Исследование биораспределения гибридных белков в организме мышей
3.2.28. Статистическая обработка результатов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Конструирование системы бактериального дисплея на основе гибридного аутотранспортера AT877 Psychrobacter cryohalolentis K5T
4.1.1. Экспрессия 10Fn3 в E. coli с использованием транслокаторного домена AT877
4.1.2. Экспрессия АТ с гибридными пассажирскими доменами, включающими 10Fn3 и Est877 или EstPc
4.1.3. Конструирование и экспрессия комбинаторной библиотеки вариантов генов 10Fn3 в плазмиде pEFN877
4.1.4. Селекция комбинаторной библиотеки методом бактериального дисплея
4.1.5. Получение и характеристика ФНО-связывающих белков
4.2. Гибридные флуоресцентные белки на основе 10Fn3
4.2.1. Конструирование гибридных флуоресцентных белков на основе 10Fn3 и оптимизация их экспрессии в клетках E.coli
4.2.2. Исследование физико-химических свойств ГФБ
4.2.3. Исследование возможности использования гибридных флуоресцентных белков для визуализации целевых лигандов методом конфокальной микроскопии
4.2.4. Исследование возможностей использования ГФБ для визуализации маркеров воспаления эндотелия и неоангиогенеза в 3D культурах клеток Ea.hy926
4.2.4.1. Получение 3D культур на основе клеточной линии Ea.hy926
4.2.4.2. Оценка связывающей способности ГФБ к avßs-интегрину и VEGFR-2 в 2D и 3D (сфероидах) культурах клеточной линии Ea.hy926 методом конфокальной микроскопии
4.2.5. Анализ связывающей способности ГФБ на образцах ткани рака поджелудочной железы человека методом конфокальной микроскопии
4.3. Получение гибридных белков пролонгированного действия на основе альбумин -связывающего домена (ABD) и avß3-интегрин-связывающего варианта 10Fn3
4.3.1 Конструирование и экспрессия гибридных белков
4.3.2. Изучение взаимодействия гибридных белков с альбумином
4.3.3. Исследование связывания гибридных белков с avß3-интегрином методом конфокальной микроскопии
4.3.4. Изучение термической стабильности гибридных белков
4.3.5. Фармакокинетика и биораспределение гибридных белков
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ