ГУРМАЧ ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ. ПОШУК in Silico ЛІГАНДІВ ДЛЯ ДОМЕНІВ SH2

Краткое описание

ГУРМАЧ ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ. Назва дисертаційної роботи: "ПОШУК in Silico ЛІГАНДІВ ДЛЯ ДОМЕНІВ SH2"

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
ГУРМАЧ ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ
УДК 577.322.23+616.379−008.64: 616.85
ПОШУК in Silico ЛІГАНДІВ ДЛЯ ДОМЕНІВ SH2
03.00.02-біофізика
Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Науковий керівник:
Прилуцький Юрій Іванович
доктор фізико-математичних наук,
професор
Київ–2015
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ 5
ВСТУП 6
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 12
1.1. Протеїн-протеїнова взаємодія 12
1.2. Домени SH2 14
1.2.1. Будова та функції доменів SH2 14
1.2.2. Компоненти доменів SH2 людини 17
1.2.3. Неохарактеризовані/слабко охарактеризовані домени SH2 19
1.2.4. Дефекти, пов’язані з доменами SH2 20
1.2.5. Структурне та функціональне різноманіття доменів SH2 22
1.2.6. Фосфотирозин-незалежні взаємодії доменів SH2 26
1.2.7. Класифікація доменів SH2 27
1.3. In silico методи дослідження 32
1.3.1. Вирівнювання амінокислотних послідовностей протеїнів 32
1.3.2. Вирівнювання структур протеїнів 34
1.3.3. Розпізнавання функціональних сайтів 35
1.3.4. Молекулярний докінг 35
1.3.5. Алгоритми молекулярного докінгу 37
1.4. Узагальнення до огляду літератури 39
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ 40
2.1. Апаратне та програмне забезпечення 40
2.2. Отримання 3D структур доменів SH2 та їх аналіз 40
2.2.1. Отримання сету 3D структур доменів SH2 40
2.2.2. Порівнювання отриманих структур доменів SH2 та їх поділ
на групи за подібністю амінокислотних послідовностей 41
2.2.3. Конформаційний пошук доменів SH2 42
2.2.4. Кластеризація доменів SH2 методом k-середніх 43
3
2.2.5. Аналіз вирівнюваних амінокислотних позицій та одержаних
груп 45
2.2.6. Визначення оточення сайту зв’язування доменів SH2 46
2.3. Підготовка бази хімічних речовин до проведення молекулярного
докінгу 47
2.3.1. Відбір бібліотеки потенційних лігандів 47
2.3.2. Підготовка отриманих баз хімічних речовин до моделювання 49
2.4. Моделювання комплексів типу “домен SH2-ліганд” 51
2.4.1. Застосування пакету MOE 52
2.4.2. Застосування пакету flo+ 53
2.4.3. Побудова фармакофорних моделей 54
2.4.4. Генерація декоїв 55
2.4.5. ROC – аналіз 55
2.4.6. Віртуальний скринінг 56
2.4.7. Модель GTM 57
2.5. Біологічне тестування отриманих структур 57
2.5.1. Оцінка впливу відібраних речовин на фосфорилювання STAT3 57
2.5.2. Оцінка проліферативної активності різних клітинних ліній
за дії досліджуваних речовин 58
2.5.3. Визначення кіназної активності Btk та Syk кіназ 59
РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
60
3.1. Структурний аналіз доменів SH2 60
3.1.1. Відбір репрезентативних структур та їх розподіл на групи 60
3.1.2. Характеристика доменів SH2 в межах кожної групи 63
3.1.3. 3D оточення сайту зв’язування 69
3.1.4. Конформаційний пошук для доменів SH2 72
3.2. Моделювання комплексу “домен SH2-ліганд” 78
3.2.1. Молекулярний докінг доменів SH2 78
3.2.2. Фармакофорні моделі 87
4
3.2.3. Валідація фармакофорних моделей 91
3.2.4. Віртуальний скринінг та побудова моделей GTM 92
3.3. Експериментальна перевірка 94
3.3.1. Оцінка впливу відібраних речовин на фосфорилювання
домену SH2 протеїну STAT3 та проліферацію пухлинних клітин 94
3.3.2. Дія відібраних речовин на кіназну активность Btk та Syk кіназ 101
РОЗДІЛ 4. УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ 103
ВИСНОВКИ 112
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 114
5
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
PPI протеїн-протеїнова взаємодія (protein-protein interaction)
SH2 родина доменів PPI (src homology 2)
ЯМР ядерний магнітний резонанс
PDB база даних протеїнів (Protein Data Bank)
Pfam база родин протеїнів (Protein families database)
Btk тирозинкіназа Брутона (Bruton's tyrosine kinase)
Syk нерецепторна тирозинкіназа (Spleen tyrosine kinase)
QXP швидкий пошук (Quick eXPlore)
GTM генеративні топографічні карти (Generative topographic map)
STAT сигнальний протеїн та активатор транскрипції (signal
transducer and activator of transcription)
pTyr фосфотирозин (phosphorylated tyrosine)
PTK протеїн тирозин кінази (protein tyrosine kinase)
ADME поглинання, розподіл, метаболізм, виділення (absorption,
distribution, metabolism, excretion)
ID ідентифікаційний номер (identification number)
Rmsd середньоквадратичне відхилення від початкової координати
атома (Root-mean-square deviation of atomic positions)
ASA доступна площа поверхні (accessible surface area)
ROC робоча характеристика сигналу (receiver operating
characteristic)
AUC площа під кривою (area under curve)
6
ВСТУП
Актуальність теми. Сукупність протеїнових структур формує складну
мережу взаємодій, під час яких відбувається передача сигналів як всередині
клітини, так і між ними [1]. Протеїн-протеїнова взаємодія (PPI) – це
постійний або тимчасовий фізико-хімічний вплив протеїнових структур одна
на одну (утворення/руйнування високомолекулярних комплексів). Ця
взаємодія відбувається завдяки різноманіттю протеїнових доменів [2], які
входять до складу протеїнових структур, характеризуються компактністю [3]
та широким спектром функцій [4]. Так, наприклад, домени SH2 входять до
складу протеїнкіназ (Src, Lck), фосфатаз (SHP2, SHIP2), фосфоліпаз (PLCγ1),
факторів транскрипції (STAT), регуляторних (SOCS), адаптерних (Grb2) і
структурних протеїнів (SHC). Враховуючи таку розповсюдженість
протеїнових доменів, їх розглядають як зручні терапевтичні мішені [5].
Водночас, пошук in silico нових сполук зі специфічною біологічною
дією є складним завданням, яке потребує використання сучасних методів
молекулярного моделювання [6], достатньої кількості структурних і
біологічних даних щодо мішені (підтверджені активні та неактивні речовини,
відомі комплекси протеїну мішені та ліганду).
SH2 – компактний глобулярний домен, що містить близько 100
амінокислот, які формують дві α – спіралі (αА, αВ) та сім β – складок (βG, βB,
βC, βD, βD', βE і βF). Його основна функція - взаємодія зі структурами, що
містять фосфорильований залишок тирозину (рTyr). Здебільшого домени SH2
містяться в онкопротеїнах (Src oncoprotein) та протеїнах, які входять до
сигнальних каскадів клітини. Встановлено зв’язок доменів SH2 з процесами,
пов’язаними з онкозахворюваннями [7]: Наприклад, порушення в їх
функціонуванні викликають гострий лімфобластний [8], хронічний
мієлоцитарний [9] та ювенальний мієломоноцитарний [10] лейкози тощо.
Важливо, що для цієї родини доменів відомі зв’язані з лігандом або іншими
7
протеїнами структури (наприклад, PDB – 1O49, 2GE9). Саме тому поміж
великої кількості доменів PPI, як мішень, обрали домени SH2.
Домени SH2 можна поділити залежно від специфічності розпізнавання
pTyr-залишку із С-кінця: таке розпізнавання відбувається у позиціях +1, +2 та
+3 [5]. Отже, можна припустити, що кожен окремий домен SH2 зв’язується
лише з конкретним pTyr-фрагментом. Наприклад, Src SH2 переважно
розпізнає Glu-Glu-Ile (взаємодіючий фрагмент pYEEI), а Grb2 SH2
зв’язується з іншим фрагментом – pYVNV. Однак повне розуміння цього
ефекту потребує детального вивчення термодинамічних особливостей
взаємодії фосфопептидів з доменами SH2.
Наразі відомо близько 10 низькомолекулярних структур, здатних
інгібувати домени SH2. Враховуючи таку їх незначну кількість, пошук нових
лігандів є важливим завданням, вирішення якого сприятиме
створенню/виявленню нових хемотипів як елементів ефективних лікарських
засобів для профілактики хвороб, пов’язаних з порушеннями функціонування
доменів SH2.
Застосування комп’ютерних методів для пошуку низькомолекулярних
лігандів на основі визначених тривимірних структур передбачає відбір сету
потенційно активних лігандів щодо тієї чи іншої мішені. У роботі
застосовано комплекс методів комп’ютерного моделювання для створення
універсальної цільової бібліотеки потенційних інгібіторів доменів SH2.
Тобто, отриманий сет речовин можна застосувати для пошуку активних
речовин для будь-якого домену SH2 під час біологічного тестування.
Активність і специфічність отриманих активних сполук з такого сету буде
підвищуватись шляхом їх модифікування відносно функціональних
особливостей конкретного домену SH2. Нарешті, одержані результати
комп’ютерного моделювання потребують перевірки на різних біологічних
моделях.
8
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Робота виконувалась в межах наукової тематики ННЦ «Інститут біології» за
номером держреєстрації 0111U004648 «Механізми реалізації адаптаційнокомпенсаторних реакцій організму за умов розвитку різних патологій» (№ 11
БФ-036-01).
Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягає у створенні
цільової бібліотеки потенційних лігандів доменів SH2 та їх перевірці на
біологічних моделях.
Для досягнення цієї мети були поставлені такі наукові завдання:
1. використовуючи наявні бази даних структур доменів SH2 та
активних речовин щодо них, провести розподіл цих доменів на
групи/кластери, виділити шаблонні структури та відібрати репрезентативний
сет речовин з наявного пулу низькомолекулярних потенційних лігандів;
2. оцінити геометричні характеристики відібраних доменів SH2 та
порівняти їх;
3. виділити ключові точки зв’язування доменів SH2 з нативними
лігандами;
4. створити цільову бібліотеку потенційних лігандів доменів SH2;
5. провести експериментальну перевірку отриманих сполук щодо їх
впливу на проліферацію пухлинних ліній клітин K562, U937, A431 і LNCap
та кіназну активність Btk та Syk.
Об’єкт дослідження – домени SH2, низькомолекулярні ліганди.
Предмет дослідження – фізико-хімічні властивості кишені зв’язування
доменів SH2, структурні особливості активних речовин щодо доменів SH2,
нековалентна взаємодія комплексу “домен-ліганд”.
Методи дослідження – попарне та множинне порівняння
амінокислотних послідовностей; метод аналізу якості вирівнювання
амінокислотних послідовностей (оцінка консервативності та ідентичності);
метод k-середніх; метод геометричного аналізу (значення величини Rmsd
9
між структурами, які порівнюються, та доступність взаємодіючих
поверхонь); чотиривимірна енергетична мінімізація структур; гнучкий
докінг; побудова прямих/структурно-залежних та непрямих/ліганд-залежних
фармакофорних моделей; метод GTM (генерування топографічних карт);
оцінка впливу отриманих сполук на фосфорилювання протеїну STAT3,
проліферацію пухлинних клітин шляхом детектуванням флуоресценції за
використання резазурину та кіназну активность Btk та Syk шляхом
детектування люмінесценції АДФ.
Наукова новизна отриманих результатів.
1. Усі наявні структури доменів SH2 поділено на групи за
одновимірною та тривимірною подібністю.
2. Виділено основні структурні частини доменів SH2, які беруть участь
у зв’язувані з лігандом; серед них виявлено найбільш та найменш гнучкі.
3. Запропоновано оригінальний алгоритм застосування методів
ком’ютерного моделювання для створення цільової бібліотеки потенційних
лігандів доменів SH2.
4. Побудовано фармакофорні моделі доменів SH2.
5. Одержано нові хемотипи, зокрема бензолсульфонамід та піримідин,
які потенційно можуть виступати замінниками pTyr - частини пептидних
лігандів при зв’язуванні з доменами SH2.
6. Встановлено речовини, які впливають на проліферацію пухлинних
клітин ліній K562, U937, A431 та LNCap, проявляють інгібуючий ефект щодо
домену SH2 протеїну STAT3 і здатні специфічно інгібувати кіназну
активність Btk та Syk.
Практичне значення отриманих результатів.
1. Запропонований алгоритм відбору потенційних низькомолекулярних
лігандів для доменів SH2 може бути ефективним для різних класів протеїнів.
2. Отримана бібліотека потенційно активних речовин може бути
застосована для пошуку лігандів відносно будь-якого домену SH2 у
біологічному тесті.
10
3. Знайдені біологічно активні сполуки можуть бути використані для
розробки нових лікарських засобів.
Особистий внесок здобувача. Основна частина дисертації є
самостійною науковою працею, у якій висвітлені власні ідеї/підходи щодо
застосування різноманітних методів комп’ютерного моделювання для
вирішення поставлених завдань. Автор самостійно опрацював літературні та
експериментальні дані. Планування та обговорення усіх етапів дослідження
проведені за участі наукового керівника, співробітників хімБіоЦентру
Київського національного університету імені Тараса Шевченка та професора
А. Варнека (Франція, Університет м. Страсбург). Аспірант виконав: розподіл
доменів SH2 на групи і кластери; провів аналіз кристалографічних даних
доменів; проаналізував відомі активні речовини стосовно доменів; провів
молекулярний докінг; побудував фармакофорні моделі; виконав віртуальний
і частково біологічний скринінги; побудовав GTM моделі; оцінив енергетичні
характеристики зв’язування при утворенні комплексів “ліганд-домен”;
самостійно встановлював та налаштовував програмне і апаратне
забезпечення на усіх етапах розрахунків; активно обговорював отримані
результати, займався написанням наукових статей і висвітленням результатів
на конференціях.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були
представлені і доповідались на VII міжнародній науково-технічній
конференції «БФФХ-2012» (23-27 квітня 2012 р., м. Севастополь, Україна);
2
nd Ukrainian-French School-Seminar «Carbon Nanomaterials: Structure and
Properties» (16-20 September 2013, Beregove, Ukraine); ХІ міжнародній
науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ в біології”
(Львів, 20-23 квітня 2015р.); V Ukrainian–German Symposium on Physics and
Chemistry of Nanostructures and on Nanobiotechnology (21–25 September 2015,
Kyiv, Ukraine); International Conference for Young Scientists (21–25 September
2015, Kyiv, Ukraine), а також на наукових семінарах кафедри біофізики та
11
ННЦ “Інститут біології” Київського національного університету імені Тараса
Шевченка.
Публікації. За матеріалами дисертації у наукових виданнях
опубліковано 11 праць: 6 статей [6, 11, 12, 13, 14, 15] (одна з яких є
оглядовою) у вітчизняних наукових фахових виданнях, з них 3 статті у
журналах, включених до наукометричної бази даних Scopus; 5 тез наукових
доповідей на міжнародних конференціях [16, 17, 18, 19, 20].
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 135
сторінках тексту, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів
та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення,
узагальнення результатів дослідження, висновків і списку літератури, який
включає 209 джерела, з них 205 англомовні. Дисертаційна робота містить 19
таблиць, 22 рисунки

Список литературы

ВИСНОВКИ
1. Домени SH2 є висококонсервативними структурами, особливо в
межах сайту зв’язування. Найбільш консервативним є pTyr-зв’язуюча
частина домену, а найменш – гідрофобна частина кишені звя’зування.
2. За геометричними параметрами домени SH2 є практично
ідентичними (значення Rmsd змінюється в межах 2 Å). Вони
характеризуються незначною рухливістю, яка змінюється в межах 1.5–5.5 Å.
Найбільш рухливою виявилась αА-спіраль, а найменш – βD-складка.
3. Отримані групи доменів SH2 характеризуються значною
подібністю: в межах кожної окремої групи спостерігаються домени лише
одного або подібних типів протеїнів.
4. Окрім консервативних ділянок в межах кожної окремої групи
виявили чотири висококонсервативних позиції (>70%): позиція 3 ділянки 1,
позиції 1 і 3 ділянки 3 та позиція 3 ділянки 5. Усі інші частини сайту
зв’язування є менш консервативними (<70%). Також встановили декілька
позицій, які не є унікальними для тієї чи іншої групи: T (позиція 37 - група
3), L (позиція 69 - група 4) та Q (позиція 40 - група 6).
5. Виділено ключові точки зв’язування типу “домен SH2-ліганд”:
(1) зв’язування з pTyr/карбоновою кислотою (характеризується великою
кількістю донорів Н-зв’язку (Arg, Lys)); (2) біля pTyr-зв’язуючої частини
знаходиться ароматична/гідрофобна частина ліганду; (3) центр кишені
зв’язування визначається позицією O амінокислотного залишку другої
амінокислоти (His); (4) наявність однієї або двох гідрофобних кишень, які
знаходяться за центром активного сайту.
6. Отримали чотири основні моделі молекулярного докінгу
зв’язування типу “домен SH2-ліганд”. Практично у всіх випадках ліганд
щільно заповнює фосфотирозинову кишеню зв’язування та бере участь у
водневих взаємодіях з ключовими амінокислотами Arg або Lys. Крім того,
115
присутні стеричні взаємодії між лігандом та амінокислотами Glu, Val, Pro,
His і Ser. Під час біологічного тестування, модель, яка передбачає
зв’язування з масивними гетероциклами не підтвердилась. Отримали три
бібліотеки потенційних лігандів доменів SH2, що складали: 1015, 3018 і
10463 структур (останні дві використані у біологічному тестуванні).
7. Побудовано дев’ять фармакофорних моделей, які відображають
декілька варіантів зв’язування доменів SH2 з лігандом. Валідація показала,
що усі одержані фармакофори можуть бути застосовані для пошуку
потенційних лігандів доменів SH2. Значення величини AUC в отриманих
моделях знаходяться в діапазоні 75-100%. Одна частина моделей краще
відбирає активні речовини і відсіює декої (моделі 1, 2, 3, 6, 8 визначені, як
найкращі), а інша (моделі 4, 5, 7) – краще відсіює декої або відбирає активні
речовини. Як наслідок, відібрано 1816 речовин, які застосували у GTM
передбаченні і одержали 1607 речовин, що відповідають ключовим точкам
взаємодії, застосованих під час докінгу та фармакофорного пошуку.
8. Перевірка отриманих потенційних лігандів доменів SH2 щодо їх
впливу на проліферативну активність пухлинних клітин та кіназну активність
Btk та Syk кіназ людини виявила значний інгібуючий ефект (65-95%).