Изучение амилоидогенной трансформации альфа-синуклеина Баринова Ксения Вячеславовна

Краткое описание

Баринова,КсенияВячеславовна.Изучениеамилоидогеннойтрансформацииальфа-синуклеина: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.08 /БариноваКсенияВячеславовна; [Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова]. - Москва, 2017. - 233 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского На правах рукописиКсенияВячеславовнаБАРИНОВАИЗУЧЕНИЕАМИЛОИДОГЕННОЙТРАНСФОРМАЦИИΑЛЬФА-СИНУКЛЕИНА03.01.08

стр. 2
...................................................................................... 20 1. Структура и функцииальфа-синуклеина.................................................... 20 1.1.Амилоидогенныехарактеристикиальфа-синуклеина............................ 24 2. Влияние модификацийальфа-синуклеинана процесс

стр. 86
проанализированы вручную. 86 7.Изучениефибриллизацииальфа-синуклеина7.1. Фибриллизацияальфа-синуклеинаПроцесс фибриллизации изучали для исходного препарата рекомбинантного α-синуклеина, содержавшего смесь двух форм белка (дикого типа Tyr136 и мутантного Tyr136Cys), а также для чистых препаратов α-синуклеина

Оглавление диссертациикандидат наук Баринова Ксения Вячеславовна
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Структура и функции алъфа-синуклеина
1.1. Амилоидогенные характеристики алъфа-синуклеина
2. Влияние модификаций алъфа-синуклеина на процесс агрегации
2.1. Окисление остатков метионина
2.2. Окисление и нитрование остатков тирозина
2.3. Окисление алъфа-синуклеина, опосредованное металлами
2.4. Окисление алъфа-синуклеина, опосредуемое белками
2.5. Протеасомная и лизосомная деградация окисленного алъфа-синуклеина
2.6. Фосфорилирование
2.7. Ацетилирование
2.8. Образование аддукта с липидами
2.9. Образование пор в клеточной мембране, опосредуемое алъфа-синуклеином
2.10. Убиквитинирование
2.11. Сумоилирование
2.12. Иммунный ответ на модифицированный алъфа-синуклеин
3. Гликирование и его связъ с болезнъю Паркинсона
4. Структура соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека и ее связь с нейродегенерацией
4.1. Негликолитические функции ГАФД
5. Взаимодействие ГАФД и а-синуклеина
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
МАТЕРИАЛЫ
МЕТОДЫ
1. Выделение алъфа-синуклеина человека
1.1. Получение плазмиды pET33b+, содержащей последовательность алъфа-синуклеина с гистидиновым тэгом
1.2. Получение плазмиды pET33b+, содержащей последовательность алъфа-синуклеина без гистидиновог тэга
1.3. Выделение плазмиды pET33b+, содержащей последовательность альфа-синуклеина с гистидиновым тэгом и без тэга, из культуры клеток E.coli штамма JM109
1.4. Получение клеток E.coli штамма BL21(DE3), продуцирующих рекомбинантный альфа-синуклеин человека
1.4.1. Получение компетентных клеток E.coli штамма BL21(DE3)
1.4.2. Трансформация клеток E.coli штамма BL21(DE3) плазмидной ДНК67
1.5. Получение рекомбинантного альфа-синуклеина человека с гистидиновым тэгом
1.5.1. Культивирование клеток-продуцентов
1.5.2. Выделение рекомбинантного альфа-синуклеина человека с
гистидиновым тэгом
3
1.6. Выделение рекомбинантного алъфа-синуклеина человека без вставок
1.6.1. Карбоксиметилирование алъфа-синуклеина йодацетатом
1.6.2. Очистка рекомбинантного алъфа-синуклеина человека на тиол-сефарозе
2. Выделение соматической глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) человека
2.1. Клонирование гена человеческой ГАФД в клетках E.coli штамма Rosetta 2 ^3)
2.2. Кулътивирование штамма-продуцента
2.3. Выделение рекомбинантной ГАФД человека из штамма клеток-продуцентов
2.3.1. Экстракция белка и фракционирование сулъфатом аммония
2.3.2. Кристаллизация рекомбинантной человеческой ГАФД
2.3.3. Гелъ-хроматография на сефадексе G-100
2.3.4. Хранение рекомбинантной ГАФД человека
2.4. Определение ферментативной активности глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназы
2.5. Определение концентрации NAD+
2.6. Определение концентрации 3-ФГА
3. Получение поликлональных антител кролика против альфа-синуклеина человека
3.1. Иммунизация кролика рекомбинантным альфа-синуклеином человека с гистидиновым тэгом
3.2. Очистка антисыворотки против алъфа-синуклеина на активированной CNBr-сефарозе
3.3. Очистка антисыворотки против алъфа-синуклеина на колонке с белком G, а затем на колонке с активированной CNBr-сефарозой
3.4. Точечный иммуноблоттинг
3.5. Иммуноблоттинг
4. Определение концентрации белка
5. ДСН-электрофорез
6. MALDI масс-спектрометрия и MS/MS анализ
7. Изучение фибриллизации алъфа-синуклеина
7.1. Фибриллизация алъфа-синуклеина
7.2. Тиофлавиновая флуоресценция
7.3. Спектроскопия кругового дихроизма
7.3.1. Исследование спектров КДрастворимого алъфа-синуклеина
7.3.2. Исследование спектров КД фибрилл алъфа-синуклеина
7.3.3. Исследование спектров КД агрегатов алъфа-синуклеина
7.4. Динамическое лазерное светорассеяние
7.5. Турбидиметрический метод (определение мутности раствора)
8. Влияние гликирования на фибриллизацию алъфа-синуклеина
8.1. Гликирование алъфа-синуклеина сахарами
8.2. Определение ранних продуктов гликирования
8.3. Определение поздних продуктов гликирования алъфа-синуклеина
9. Электронная микроскопия агрегатов альфа-синуклеина
10. Изучение взаимодействия рекомбинантных ГАФД и альфа-синуклеина человека различными методами
10.1. Изучение взаимодействия ГАФД человека и альфа-синуклеина методом твердофазного иммуноферментного анализа
10.2. Изучение взаимодействия рекомбинантной ГАФД человека с альфа-синуклеином методом иммунопреципитации
10.3. Инактивация рекомбинантной ГАФД человека в присутствии альфа-синуклеина
10.4. Влияние окисления сульфгидрильных групп рекомбинантной ГАФД человека на инактивацию в присутствии альфа-синуклеина
10.5. Аналитическое ультрацентрифугирование комплексов соматической ГАФД человека или кролика и альфа-синуклеина
10.6. Дифференциальная сканирующая калориметрия
10.7. Влияние рекомбинантной ГАФД человека на фибриллизацию альфа-синуклеина
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выделение рекомбинантного альфа-синуклеина человека
1.1. Экспрессия альфа-синуклеина в клетках E.coli штамма BL21(DE3)
1.2. Выделение рекомбинантного альфа-синуклеина человека из клеток штамма-продуцента
1.3. Карбоксиметилирование альфа-синуклеина
1.4. Отделение цистеин-содержащей фракции рекомбинантного альфа-синуклеина человека на колонке с тиол-сефарозой
1.5. Масс-спектрометрический анализ фракций рекомбинантного алъфа-синуклеина человека
2. Получение поликлоналъных антител кролика против рекомбинантного алъфа-синуклеина человека
3. Выделение рекомбинантной ГАФД человека
3.1. Экстракция и фракционирование сульфатом аммония
3.2. Гелъ-хроматография на сефадексе G-100
3.3. MALDI-TOFмасс-спектрометрический анализ
3.4. Иммуноблоттинг
3.5. Реактивация рекомбинантной ГАФД человека после хранения
4. Влияние различных факторов на фибриллизацию алъфа-синуклеина
4.1. Агрегация и фибриллизация различных форм а-синуклеина
4.1.1. Анализ тиофлавиновой флуоресценции
4.1.2. Спектроскопия кругового дихроизма агрегатов алъфа-синуклеина
4.2. Гликирование алъфа-синуклеина
4.2.1. Детекция ранних и поздних продуктов гликирования алъфа-синуклеина
4.2.2. Масс-спектрометрический анализ проб гликированного алъфа-синуклеина
4.2.3. Анализ тиофлавиновой флуоресценции и мутности раствора при агрегации алъфа-синуклеина после гликирования
4.2.4. Анализ спектров КД гликированного алъфа-синуклеина
4.2.5. Анализ агрегатов гликированного альфа-синуклеина методом электронной микроскопии
5. Анализ образования комплексов между соматической ГАФД человека и альфа-синуклеином
5.1. Определение взаимодействия рекомбинантной ГАФД человека и альфа-синуклеина методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)
5.2. Изучение взаимодействия рекомбинантной ГАФД человека и альфа-синуклеина методом иммунопреципитации
5.3. Инактивация рекомбинантной ГАФД человека в присутствии альфа-синуклеина
5.4. Влияние окисления сульфгидрильных групп на инактивацию рекомбинантной ГАФД человека в присутствии альфа-синуклеина
5.5. Влияние кофактора NAD+, ионной силы буфера и концентрации белка на инактивацию рекомбинантной ГАФД человека в присутствии альфа-синуклена
5.6. Изучение взаимодействия рекомбинантной ГАФД человека и альфа-синуклеина методом аналитического ультрацентрифугирования
5.7. Исследование размеров комплексов рекомбинантной ГАФД человека и альфа-синуклеина методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС)
185
5.8. Термостабильность и термоагрегация комплексов ГАФД с альфа-синуклеином
5.9. Влияние рекомбинантной ГАФД человека на фибриллизацию альфа-синуклеина
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ