Мельниченко Світлана Вітаськівна. Виділення та характеристика білкових чинників, що зв’язують інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет

Краткое описание

Мельниченко Світлана Вітаськівна. Виділення та характеристика білкових чинників, що зв’язують інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет : Дис... канд. наук: 14.01.14 - 2008.

Мельниченко С.В. Виділення та характеристика білкових чинників, що зв’язують інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет. Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю14. 01. 14 ендокринологія. Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, Київ, 2007 р.
Дисертаційну роботу присвячено дослідженню білкових чинників (БЗІ), які здатні зв’язувати інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет, і визначенню антитіл до ендогенного (ІА) або екзогенного (ІАА) інсулінів у складі цих білків.
Білки, що зв’язують інсулін в сироватках крові людей, виділяли методом афінної хроматографії на сорбенті інсулін-сефароза 4В. Отриманий матеріал в подальшому фракціонували на сорбенті білок G-сефароза 4В, відокремлюючи при цьому ІА та ІАА від інших білків, що блокують дію інсуліну. Всі отримані білкові фракції досліджували методом електрофорезу в поліакриламідному гелі. Вміст ІА та ІАА, як в нативних сироватках, так і в отриманих фракціях, визначали розробленим гетерогенним твердофазним імуноферментним методом. В результаті проведення поетапної афінної хроматографії сироваток крові хворих на ЦД та донорів показано, що кількість білкових фракцій в елюатах (як від донорських сироваток, так і від хворих на ЦД) коливається від 8 до 10. Співвідношення білків в окремих зразках різні, але кількість фракцій не залежить від того, з яких сироваток від здорових людей чи від хворих на ЦД виділено ці білки.
На основі опрацьованого гетерогенного твердофазного імуноферментного методу визначення ІА та ІАА створено тест-систему ІФА-АТ-інс”. Проведено порівняльне дослідження тест-системи ІФА-АТ-інс” з імуноферментною комерційною системою Anti-insulin ORG-520” виробництва фірми ORGentech” (Німеччина) засвідчило її ефективність при виявленні антитіл до екзогенного (або ендогенного) інсуліну як у нативних сироватках, так і в складі білкових фракцій, виділених методом поетапної афінної хроматографії з сироваток крові людей. Використання методу поетапної афінної хроматографії і дослідження вмісту ІА та ІАА в отриманих елюатах дозволило пояснити розбіжності в результатах визначення цих антитіл методами імуноферментного та радіоімунного (РІА) аналізів. Причиною такого явища може бути те, що в РІА, для вилучення комплексів125І-інсуліну з ІА або ІАА використовують поліетиленгліколь. Останній, крім антитіл до інсуліну, здатен осаджувати також й інші БЗІ і тим самим, призводити до завищення результатів визначення ІА та ІАА.

Вперше застосовано метод поетапної афінної хроматографії на сорбентах з інсуліном та білком А (або G) і продемонстровано його придатність для відокремлення антитіл до інсуліну від інших білків, що зв’язують інсулін в сироватках крові хворих на ЦД та здорових людей. Показано, що вміст білкових чинників, причетних до зв’язування інсуліну, в сироватках хворих на ЦД в 2,5 3 рази вищий, ніж у здорових людей.
Вперше в Україні розроблено метод гетерогенного твердофазного імуноферментного аналізу для визначення вмісту антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів у крові людей. Доведено його ефективність для виявлення ІА та ІАА, як в цільній сироватці крові людей, так і у складі білкових фракцій, виділених методом поетапної афінної хроматографії з цих сироваток.
Встановлено, що специфічність розробленого імуноферментного методу становить 90,9 %, а чутливість 82,4 %; внутрішньосерійний коефіцієнт варіації складає 9,09 % для негативних зразків і 3,53 % для позитивних, а міжсерійний 4,34 % для негативних зразків і 5,5 % для позитивних.
На основі розробленого методу створено вітчизняну імуноферментну тест-систему ІФА-АТ-інс” та показано її придатність для виявлення ІА та ІАА при обстеженні здорових людей та хворих на ЦД.
За допомогою розробленої тест-системи проведено визначення антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів в сироватках крові здорових людей, та хворих на ЦД-1 і ЦД-2, які приймали таблетовані цукрознижуючі препарати, ін’єкції інсуліну або його аналогів. Відсоток осіб, у крові яких виявлено ІА або ІАА, у групі хворих на ЦД-1 дорівнював 10,96; у хворих на ЦД-2, лікованих інсуліном 4,26; хворих на ЦД-2, які не отримували інсулін 1,92. Серед донорів ІАА виявлено у однієї особи (0,52 % від загальної кількості обстежених).
Проведене порівняльне дослідження тест-системи ІФА-АТ-інс” з імуноферментною комерційною системою Anti-insulin ORG-520” виробництва фірми ORGentech” (Німеччина), засвідчило її ефективність при визначенні антитіл до екзогенного (або ендогенного) інсуліну.