Новые моно- и бифункциональные конструкции на основе 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров для детекции гемоглобина человека Давыдова Анна Сергеевна

Краткое описание

Давыдова, Анна Сергеевна.
Новые моно- и бифункциональные конструкции на основе 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров для детекции гемоглобина человека : диссертация ... кандидата химических наук : 1.4.9 / Давыдова Анна Сергеевна; [Место защиты: ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук]. - Новосибирск, 2021. - 142 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат наук Давыдова Анна Сергеевна
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. АПТАМЕРЫ КАК УЗНАЮЩИЕ ЭЛЕМЕНТЫ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БИОМАРКЕРОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Получение аптамеров методом SELEX
1.2. Дизайн комбинаторных библиотек для селекции in vitro
1.3. Химические модификации библиотек для SELEX
1.4. Применение аптамеров
1.5. Аптасенсоры для детекции биомаркеров различных заболеваний в крови
1.5.1. Биомаркеры злокачественных заболеваний
1.5.1.1. Фактор роста эндотелия сосудов
1.5.1.2. CD63 как основной белок экзосом
1.5.1.3. Муцин-1
1.5.1.4. Раковый эмбриональный антиген
1.5.1.5. Другие маркеры онкологических заболеваний
1.5.2. Биомаркеры нейродегенеративных заболеваний
1.5.2.1. Дофамин
1.5.2.2. Другие маркеры нейродегенеративных заболеваний
1.5.3. Биомаркеры стресс-опосредованных заболеваний
1.5.4. Биомаркеры воспалительных заболеваний
1.5.5. Биомаркеры сердечно-сосудистых заболеваний
1.5.6. Биомаркеры сахарного диабета
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы и ферменты
2.1.2. Буферные растворы
2.2. Методики эксперимента
2.2.1. Химический синтез, деблокирование и очистка ДНК-библиотек и праймеров для их амплификации
2.2.2. Исчерпывающий гидролиз ДНК-библиотек с помощью фосфодиэстеразы змеиного яда
2.2.3. Ферментативный синтез двуцепочечных ДНК-библиотек
2.2.4. Синтез 2'-Б-РНК-библиотеки методом транскрипции in vitro
2.2.5. Химический синтез, деблокирование и очистка индивидуальных 2'-Б-РНК-аптамеров
2.2.6. Химический синтез, деблокирование и очистка индивидуальных ДНК-аптамеров59
2.2.7. Иммобилизация белковых мишеней для проведения селекции
2.2.7.1. Ковалентная иммобилизация белков-мишеней на магнитных частицах
2.2.7.2. Нековалентная иммобилизация His6-содержащих белков на Ni-сорбентах
2.2.8. In vitro селекция 2'-Б-РНК-аптамеров к белковым мишеням
2.2.8.1. Отбор 2'-Б-РНК-аптамеров, связывающих суммарный гемоглобин
2.2.8.2. Отбор 2'-Б-РНК-аптамеров, связывающих гликированный гемоглобин HbA1c
2.2.8.3. Отбор 2'-Б-РНК-аптамеров, связывающих фотопротеин обелин
2.2.8.4. Анализ обогащения библиотек в ходе селекции аптамеров
2.2.8.5. Высокопроизводительное секвенирование на платформе MiSeq (Illumina) и анализ полученных данных
2.2.9. Введение радиоактивной метки на 5'-конец 2'-Р-пиримидин-модифицированных РНК-библиотек и индивидуальных аптамеров
2.2.10. Синтез конъюгатов 2'-Б-РНК-аптамеров
2.2.10.1. Синтез биотинилированных производных индивидуальных аптамеров
2.2.10.2. Синтез флуоресцентно меченых индивидуальных аптамеров
2.2.11. Исследование вторичной структуры квадруплекс-формирующих 2'-Б-РНК-аптамеров, связывающих суммарный гемоглобин
2.2.11.1. КД-спектроскопия
2.2.11.2. Частичный гидролиз 2'-Б-РНК-аптамеров с помощью РНКазы Т1 в неденатурирующих условиях
2.2.11.3. Частичный гидролиз 2'-Б-РНК-аптамеров с помощью РНКазы Т1 в денатурирующих условиях
2.2.11.4. Частичный щелочной гидролиз 2'-Б-РНК-аптамеров
2.2.11.5. Флуоресцентная спектроскопия
2.2.12. Биолюминесцентный гетерофазный анализ связывания аптамеров с белками
2.2.13. Колориметрический анализ аффинности 2'-Б-РНК-аптамеров к гемоглобину
2.2.14. Анализ аффинности радиоактивно меченых 2'-Б-РНК-библиотек и индивидуальных аптамеров к обелину
2.2.14.1. Анализ образования комплексов аптамеров с обелином методом задержки в геле
2.2.14.2. Анализ формирования комплексов аптамеров с обелином методом DRaCALA
66
2.2.15. Колориметрическая микропланшетная детекция гемоглобина в формате сэндвич-системы
ГЛАВА 3. СОЗДАНИЕ НОВЫХ 2' -F -МОДИФИЦИРОВ АННЫХ РНК-АПТАМЕРОВ И АНАЛИТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ НА ИХ ОСНОВЕ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ)
3.1. Получение комбинаторной 2'-Б-РНК-библиотеки для селекции in vitro
3.1.1. Оптимизация условий химического синтеза исходной ДНК-библиотеки
3.1.2. Определение равномерности нуклеотидного состава ДНК-библиотеки
3.1.3. Секвенирование рандомизированной ДНК-библиотеки
3.1.4. Получение исходной 2'-Б-РНК-библиотеки для отбора аптамеров
3.2. Получение 2'-Б-РНК-аптамеров, связывающих суммарный (Hb) и гликированный (HbA1c) гемоглобины человека
3.2.1. In vitro селекция 2'-Б-РНК-аптамеров, связывающих различные варианты гемоглобина человека
3.2.2. Рациональный дизайн и синтез укороченных 2'-Б-РНК-аптамеров
3.2.3. Исследование связывания 2'-Б-РНК-аптамеров с белками-мишенями
3.2.3.1. Биолюминесцентный анализ аффинности индивидуальных аптамеров к суммарному и гликированному гемоглобинам
3.2.3.2. Гетерофазный колориметрический анализ аффинности аптамеров к суммарному и гликированному гемоглобинам
3.2.4. Анализ вторичной структуры 2'-Б-РНК-аптамеров, связывающих суммарный и гликированный гемоглобины
3.2.4.1. Исследование структуры 2'-F- РНК-аптамеров методом КД-спектроскопии
3.2.4.2. Частичный гидролиз 2'^-РНК-аптамеров с помощью рибонуклеазы Т1
3.2.4.3. Анализ связывания 2'^-РНК-аптамеров с квадруплекс-специфичным флуоресцентным красителем тиофлавином Т
3.2.5. Исследование возможности применения полученных 2'^-РНК-аптамеров в составе сэндвич-системы для колориметрической детекции суммарного гемоглобина
3.2.6. Конструирование сэндвич-системы детекции гликированного гемоглобина методом твердофазного биолюминесцентного анализа
3.3. Получение устойчивых в биологических средах РНК-аптамеров, связывающих фотопротеин обелин
3.3.1. Селекция in vitro 2'^-РНК-аптамеров, связывающих фотопротеин обелин
3.3.2. Дизайн и синтез укороченных 2'^-РНК-аптамеров, связывающих обелин
3.3.3. Анализ связывания индивидуальных 2'^-РНК-аптамеров с обелином
3.3.4. Влияние связывания с аптамером на биолюминесцентную активность обелина
3.3.5. Дополнительное укорочение 2'^-РНК-аптамера O79t
3.4. Бифункциональные конструкции на основе 2'^-модифицированных РНК-аптамеров для детекции гемоглобина человека
3.4.1. Дизайн бифункциональных конструкций
3.4.2. Гетерофазный биолюминесцентный анализ связывания бифункциональных аптамеров с гемоглобином
ЗАКЛЮЧЕНИЕ