Новые РНК-аптамеры и аптасенсоры для детекции аутоантител, характерных для рассеянного склероза Тимошенко Валентина Викторовна

Краткое описание

Тимошенко, Валентина Викторовна.
Новые РНК-аптамеры и аптасенсоры для детекции аутоантител, характерных для рассеянного склероза : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10 / Тимошенко Валентина Викторовна; [Место защиты: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН]. - Новосибирск, 2020. - 146 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат наук Тимошенко Валентина Викторовна
Оглавление
Список используемых сокращений
Введение
1.Аптамеры к антителам (обзор литературы)
1.1. Отбор аптамеров к иммуноглобулинам при патологиях не аутоиммунного типа
1.1.1. Отбор аптамеров к IgE
1.1.2. Аптамеры к иммуноглобулинам класса M
1.1.3. Отбор аптамеров к IgG и их фрагментам
1.2. Отбор аптамеров к иммуноглобулинам, характерным для аутоиммунных заболеваний
1.3. Применение аптамеров, способных узнавать иммуноглобулины
1.3.1. Аффинные матрицы на основе аптамеров к иммуноглобулинам
1.3.2. Биоимиджинг с использованием аптамеров
1.4. Биосенсоры на основе аптамеров
1.4.1. Аптасенсоры к IgG
1.4.2. Биосенсоры для детекции IgE
1.4.2.1. Аптасенсоры для детекции IgE методом поверхностного плазмонного резонанса
1.4.2.2. Аптасенсоры для определения IgE с колориметрическим типом детекции
1.4.2.3. Аптасенсоры для определения IgE с люминесцентным типом детекции
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1. Исходные материалы
2.2. Основные методы работы
2.3. Методики эксперимента
2.3.1. Твердофазный фосфитамидный синтез 2'-Р-модифицированных РНК-аптамеров
2.3.1.1. Приготовление растворов мономеров
2
2.3.1.2. Синтез 2'-Р-модифицированных РНК-аптамеров и их аналогов
2.3.1.3. Деблокирование олигонуклеотидов
2.3.2. Выделение ДНК-праймеров
2.3.3. Выделение оцДНК-матриц для синтеза индивидуальных аптамеров. Выделение 2'-Р-РНК-аптамеров
2.3.4. Синтез дцДНК-матриц методом ПЦР высокой точности
2.3.5. Транскрипция in vitro и выделение 2'^-пиримидинсодержащего РНК-транскрипта
2.3.6. Введение радиоактивной метки по 5'-концу 2'-модифицированного РНК-аптамера
2.3.6.1. Дефосфорилирование
2.3.6.2. Кинирование
2.3.7. Введение радиоактивной метки по 3'-концу 2'-модифицированного РНК-аптамера
2.3.8. Определение констант диссоциации комплексов 2'-Р-модифицированных РНК с антителами
2.3.8.1. Определение KD методом связывания на нитроцеллюлозных фильтрах
2.3.8.2. Определение KD методом задержки в геле
2.3.9. Получение ОБМ-сефарозы
2.3.10. Выделение антител
2.3.10.1. Выделение антител для проведения исследований связывания с аптамерами
2.3.10.2. Выделение антител для проведения серийного биолюминесцентного микропланшетного анализа
2.3.11. In vitro селекция 2'-Р-РНК-аптамеров
2.3.12. Синтез конъюгатов 2'-Р-РНК-аптамеров с обелином
2.3.13. Синтез биотинилированных конъюгатов аптамеров
2.3.14. Тестирование конъюгатов 2'-Р-РНК-аптамеров с обелином в качестве репортерных компонентов биолюминесцентного аптасенсора
2.3.15. Анализ образцов антител с использованием аптасенсора на основе пары аптамеров
2.3.16. Статистическая обработка данных
Глава 3. Создание 2'^-РНК-аптамеров к анти-ОБМ аутоантителам, характерным для РС, и разработка биосенсоров на их основе (результаты и обсуждение)
3.1. Получение серии 2'^-РНК-аптамеров
3.2. Связывание 2'^-РНК-аптамеров с анти-ОБМ антителами из крови больных РС
3.3. Исследование селективности связывания аптамера II-9 с анти-ОБМ аутоантителами
3.4. Минимизация олигонуклеотидной последовательности аптамера II-9
3.5. Дополнительная in vitro селекция аптамеров на анти-ОБМ аутоантитела
3.6. Минимизация олигонуклеотидной последовательности аптамера
3.7. Создание биолюминесцентных аптасенсоров с использованием полученных 2'-F-РНК-аптамеров в качестве узнающих элементов
3.8. Создание аптасенсора на основе пары 2'^-РНК-аптамеров к анти-ОБМ аутоантителам, характерным для РС
3.9. Оптимизация протокола использования аптасенсора на основе пары 2'^-РНК-аптамеров для анализа клинических образцов
3.10. Анализ клинических образцов от больных РС и здоровых доноров с использованием биолюминесцентного аптасенсора на основе пары 2'-F- РНК-аптамеров
Заключение