Новые устойчивые к ретроингибированию мевалонаткиназы улучшающие продукцию изопрена клетками Pantoea ananatis Казиева Екатерина Дмитриевна

Краткое описание

Казиева,ЕкатеринаДмитриевна.Новыеустойчивыекретроингибированиюмевалонаткиназы,улучшающиепродукциюизопренаклеткамиPantoeaananatis: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.03 /КазиеваЕкатеринаДмитриевна; [Место защиты: Гос. науч.-исслед. ин-т генетики и селекции промышленных микроорганизмов]. - Москва, 2019. - 137 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
Закрытое Акционерное Общество «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» На правах рукописиКазиеваЕкатеринаДмитриевнаНовыеустойчивыекретроингибированиюмевалонаткиназыулучшающиепродукциюизопренаклеткамиPantoeaananatis03.01.03 Молекулярная биология Диссертация на соискание

стр. 90
продукцииизопренаклеткамиP.ananatis. В первой части работы были найдены и охарактеризованы двеновыеустойчивыекретроингибированиюмевалонаткиназы, обладающие существенно лучшими кинетическими параметрами, чем ранее описанная MVKMma. Однако измерение кинетических параметров зачастую проводится в

стр. 91
cerevisiae, введение генов mvk из M. 91 paludicola или M. concilii, обеспечило большуюпродукциюизопрена, чем интеграция ранее известного гена из M. mazei. Таблица 9 -Продукцияизопренаштаммами, содержащими различные генымевалонаткиназ. ШтаммИзопрен, мг Глюкоза, г Выход, г/г % 0,42 0,48 0,51 ISP3.2-mvk(Mma)

Оглавление диссертациикандидат наук Казиева Екатерина Дмитриевна
1.2. Цели и задачи работы
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы
1.4. Положения выносимые на защиту
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Пути биосинтеза предшественников изопреноидов
2.1.1.1. Ацетоацетил-СоА тиолаза
2.1.1.2. Гидрокси-3-метилглутарил-СоА синтаза
2.1.1.3. Гидрокси-3-метилглутарил-СоА редуктаза
2.1.1.4. Мевалонаткиназа
2.1.1.5. Фосфомевалонаткиназа
2.1.1.6. Мевалонатдифосфатдекарбоксилаза
2.1.1.7. Изопентенилфосфатизомераза
2.1.2. Метилэритритолфосфатный путь - основной путь биосинтеза изопреноидов у бактерий
2.2. Использование гетерологичного мевалонатного пути для продукции изопреноидов в E. coli
2.3. Pantoea ananatis как бактерия с высоким биотехнологическим потенциалом
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Бактериальные штаммы и плазмиды
3.2 Среды и условия культивирования штаммов
3.3. Генно-инженерные методики
3.3.1. Проведение полимеразной цепной реакции
3.3.2. Трансформация клеток P. ananatis плазмидной ДНК с помощью процедуры электропорации
3.3.3. Проведение интеграции хромосомы в штамм P.ananatis
3.3.4. X Red-зависимая интеграция двухцепочечных фрагментов ДНК в хромосому
3.3.5. Излечивание клеток от плазмиды-помощника RSFRedTER
3.3.6. Излечивание клеток P. ananatis от термочувствительных плазмид-помощников pMW-XInt/Xis-cat, pAH123-cat, pAH129-cat
3.3.7. Интеграция в хромосому P. ananatis с помощью метода
«Dual In/Out»
3.3.8. Конструирование точек интеграции в хромосоме P. ananatis
3.3.9. Интеграция CRIM плазмид, pAH162- в сайт attß^o в хромосоме
P. ananatis
3.3.10. Выщепление плазмидной части
3.4. Конструирование штаммов и плазмид
3.4.1. Конструирование плазмид
3.4.1.1. Клонирование генов mvkmpd, mvkmcl и mvksce, mvkmma на pET векторы
3.4.1.2. Конструирование плазмиды pAH162-Pfac
3.4.1.3. Клонирование генов mvkmpd, mvkmma, mvkmc mvknmr и mvksce на интегративный вектор
3.4.2 Конструирование штаммов
3.4.2.1. Конструирование штаммов ISP3.2-mvk(X)
3.4.2.2.Консруирование штамма IR5-3A
3.4.2.3. Конструирование набора штаммов интеграцией смеси плазмид pAH162-PphoC-mvaES, pAH162-Ptac-mvk и pAH162-Ptac-KDyI в IR5-3A-S
3.5. Ферментация штаммов
3.5.1. Ферментация штаммов ISP3-mvk(X) содержащих многокопийную плазмиду с изопренсинтазой
3.5.2. Ферментация штаммов производных IR5-3A в виалах для газовой хроматографии, содержащих многокопийную плазмиду с изопренсинтазой
3.5.3. Измерение концентрации изопрена
3.6 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
3.6.1. Экспрессия и предварительный анализ активности мевалонаткиназ
3.6.2. Экспрессия и очистка рекомбинантных мевалонаткиназ из M. concilii, M. paludicola, M. mazei, N. maritimus и S. cerevisiae
3.6.3. Приготовление PMK
3.6.4. Определение кинетических параметров ферментов и ингибирование DMAPP, GPP, FPP и DPM
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Новые мевалонаткиназы и их характеристика
4.1.1. Выбор генов, предположительно кодирующих устойчивые к ретро-ингибированию мевалонаткиназы
4.1.2. Клонирование генов мевалонаткиназ из M. concilii, M. paludicola, M. mazei, N. maritimus и S. cerevisiae их экспрессия в E. coli и очистка соответствующих рекомбинантных белков
4.1.3. Определение кинетических параметров MVKMma, MVKMpd, MVKMma , MVKNmr и MVKSce
4.1.4. Превращение мевалоната в фосфо- и дифосфомевалонат in vitro в присутствии очищенной мевалонаткиназы и фосфомевалонаткиназы из S. cerevisiae
4.1.5. Проверка ингибирования различных мевалонаткиназ интермедиатами мевалонатного пути, GPP и FPP
4.1.6. Анализ генетического окружения генов mvk
4.1.7. Анализ структурных особенностей устойчивых к ретроингибированию мевалонаткиназ
4.1.8. Сопоставление продукции изопрена изогенными штаммами с разными мевалонаткиназами
4.2. Обеспечение баланса биосинтетических активностей в штамме, продуцирующем DMAPP, при введении дополнительных копий генов мевалонатного пути
4.2.1. Конструирование базового штамма для одновременной интеграции нескольких экспрессионных кассет
4.2.1.1. Необходимость модификации метода Dual In/Out
4.2.1.2. Использование модифицированного метода Dual In/Out для конструирования штамма IR5-3A
4.2.1.4. Предварительное определение лимитирующей активности MVA пути в модельном штамме
4.2.1.5. Получение набора штаммов, содержащих дополнительные копии генов MVA пути, за один раунд интеграции
4.2.2. Отбор клонов с оптимальным сочетанием числа копий генов MVA пути с увеличенной продукцией изопрена
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ