Поиск, клонирование и экспрессия гена люциферазы грибов Котлобай Алексей Анатольевич

Краткое описание

Котлобай,АлексейАнатольевич.Поиск,клонированиеиэкспрессиягеналюциферазыгрибов: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.03 /КотлобайАлексейАнатольевич; [Место защиты: Ин-т биоорган. химии им. М.М. ШемякинаиЮ.А. Овчинникова РАН]. - Москва, 2019. - 132 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
академии наук На правах рукописиКотлобайАлексейАнатольевичПоиск,клонированиеиэкспрессиягеналюциферазыгрибовСпециальность 03.01.03 «молекулярная

стр. 48
Согласно данным секвенирования, все обладающие люминесценцией клоны содержали одну и ту же последовательность ДНК, соответствующую последовательностигеналюциферазыгрибов. 2.2.3Клонированиеиэкспрессиягеналюциферазыгрибовв клетках дрожжей P. pastorisГенлюциферазыамплифицировали с помощьюген-специфичных

стр. 51
бактерий. 51 2.4 Методы работы с культурами клеток млекопитающих 2.4.1Клонированиеиэкспрессиягеналюциферазыгрибовв клетках культур HEK293NT, HeLa и СТ26Генлюциферазыамплифицировали с помощьюген-специфичных концевых праймеров 21 и 22 (Приложение 1) (см. таблицу использованных в работе праймеров,

Оглавление диссертациикандидат наук Котлобай Алексей Анатольевич
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1 Введение
1.2 Люциферазы биолюминесцентных систем, использующих люциферин светлячка
1.2.1 Люциферазы светлячков
1.2.2 Люциферазы жуков-щелкунов
1.2.3 Люциферазы железнодорожных червей
1.3 Люциферазы биолюминесцентных систем, использующих целентеразин
1.3.1 Люцифераза коралла Renilla
1.3.2 Люциферазы веслоногих ракообразных Copepoda
1.3.3 Люцифераза глубоководных креветок семейства Oplophoridae
1.4 Люциферазы биолюминесцентных систем, использующих люциферин Cypridina ...31 1.4.1 Люциферазы Cypridina
1.5 Люциферазы биолюминесцентных систем динофитовых водорослей (динофлагеллят)
1.5.1 Люцифераза Gonyaulaxpolyedra (сейчас Lingulodinium polyedrum)
1.5.2 Люцифераза Pyrocystis lunula
1.5.3 Люцифераза Noctiluca scintillians
1.6 Биолюминесцентная система бактерий
1.6.1 Люциферазы бактерий
ГЛАВА II. Материалы и методы
2.1 Методы генной инженерии
2.1.1 Выделение плазмидной ДНК из клеток бактерий
2.1.2 Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения
2.1.3 Секвенирование ДНК
2.1.4 Реакции рестрикции и лигирования
2.1.5 Амплификация ДНК
2.2 Методы работы с клетками дрожжей
2
2.2.1 Создание вектора для клонирования библиотеки кДНК из гриба Neonothopanus
nambi в клетки дрожжей Pichia pastoris
2.2.2 Клонирование библиотеки кДНК из гриба N. nambi в клетки дрожжей P. pastoris и идентификация гена люциферазы грибов
2.2.3 Клонирование и экспрессия гена люциферазы грибов в клетках дрожжей P. pastoris
2.2.4 Выделение микросомальной фракции из дрожжей P. pastoris
2.2.5 Трансформация клеток P. pastoris методом электропорации
2.3 Методы работы с бактериями
2.3.1 Трансформация клеток Escherichia coli методом электропорации
2.3.2 Клонирование и экспрессия гена люциферазы грибов в клетках E. coli
2.3.3 Ренатурация люциферазы грибов из телец включения
2.3.4 Клонирование в клетки E.coli функциональных фрагментов люциферазы грибов
2.4 Методы работы с культурами клеток млекопитающих
2.4.1 Клонирование и экспрессия гена люциферазы грибов в клетках культур HEK293NT, HeLa и СТ26
2.4.2 Разрушение клеток культур HEK293NT и HeLa
2.5 Экспрессия гена люциферазы грибов в эмбрионах Xenopus laevis
2.6 Экспрессия гена люциферазы грибов в клетках СТ26, инъецированных под кожу живой мыши
2.7 Выделение микросомальной фракции из биомассы N. nambi
2.8 Солюбилизация люциферазы грибов из микросомальной фракции
2.9 Хроматографические методы
2.9.1 Анионообменная хроматография DEAE-Sepharose и Q-Sepharose
2.9.2 Гель-фильтрационная хроматография
2.9.3 Обессоливание белка на Sephadex® G25
2.10 Электрофоретические методы
2.10.1 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.10.2 Электрофорез в ПААГ в нативных условиях
2.10.3 Двумерный ПААГ электрофорез в нативных условиях
2.10.4 Окраска геля серебром
2.10.5 Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.11 Вестерн блот
2.12 Масс-спектрометрическое секвенирование. Метод LC-MS
2.13 Метод измерения биолюминесцентной активности
2.14 Получение спектров люминесценции
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение
3.1 Получение очищенного препарата люциферазы гриба N. nambi для проведения масс-отектрометрического секвенирования
3.1.1 Выделение микросомальной фракции из биомассы гриба N. nambi
3.1.2 Подбор условий солюбилизации люциферазы N. nambi
3.1.3 Хроматографическая очистка люциферазы N. nambi
3.1.4 Электрофорез в нативных условиях
3.1.5 Масс-спектрометрическое секвенирование образцов из гелей
3.2 Клонирование библиотеки кДНК гриба N. nambi и поиск последовательности гена люциферазы
3.2.1 Клонирование библиотеки кДНК гриба N. nambi в дрожжи P. pastoris и определение последовательности гена грибной люциферазы
3.2.3 Экспрессия люциферазы N. nambi в клетках P. pastoris
3.2.4 Определение спектра биолюминесценции рекомбинантной люциферазы и его сравнение со спектром биолюминесценции мицелия гриба N. nambi
3.2.5 Люциферазы из различных видов грибов
3.2.6 Получение функциональных фрагментов люцифераы N. nambi в клетках E. coli
3.2.7 Экспрессия рекомбинантной люциферазы N. nambi в клетках E. coli
3.2.8 Ренатурация рекомбинантной люциферазы N. nambi
3.3 Примеры применения рекомбинантной люциферазы N. nambi
3.3.1 Использование люциферазы N. nambi для мечения клеток
3.3.2 Использование люциферазы N. nambi для мечения клеток внутри целого организма
Выводы
Список сокращений
Приложение
Приложение
Приложение
Список использованной литературы