Протективное химерное антитело против вируса клещевого энцефалита: получение и характеризация Матвеев Андрей Леонидович

Краткое описание

Матвеев,АндрейЛеонидович.Протективноехимерноеантителопротиввирусаклещевогоэнцефалита:получениеихарактеризация: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.03 /МатвеевАндрейЛеонидович; [Место защиты: Институт химической биологииифундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук]. - Новосибирск, 2019. - 150 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
академии наук На правах рукописиМатвеевАндрейЛеонидовичПротективноехимерноеантителопротиввирусаклещевогоэнцефалита:получениеихарактеризация03.01.03

стр. 4
.................................................................76 3.1. СОЗДАНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТАХИМЕРНОГОАНТИТЕЛАПРОТИВВИРУСАКЛЕЩЕВОГОЭНЦЕФАЛИТАНА ОСНОВЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ..............................................................................................................................76 3.1.1. Создание суспензионной линии CHO-S ...............................................................76 3.1.2.Получение...

стр. 5
....................................................................................................90 3.1.7. Создание штамма-продуцентахимерногоантителаchFVN145 с использованием гомологичной рекомбинации ..............................................................90 3.1.8. Наработка и очисткахимерногоантителапротиввирусаклещевогоэнцефалита...

Оглавление диссертациикандидат наук Матвеев Андрей Леонидович
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. КЛЕЩЕВОЙ ВИРУСНЫЙ ЭНЦЕФАЛИТ
1.1.1. Вирус клещевого энцефалита: организация вириона и жизненный цикл
1.1.2. Переносчики вируса клещевого энцефалита и способ заражения
1.1.3. Генетическое разнообразие ВКЭ
1.1.4. Патогенез КЭ
1.1.5. Методы профилактики и лечения КЭ
1.2. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЛИКОПРОТЕИНОВ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
1.2.1.Основные подходы к конструированию полноразмерных антител
1.2.2. Особенности наработки рекомбинантных гликопротеинов в клетках млекопитающих
1.2.3. Клетки млекопитающих, используемые для продукции терапевтических белков
1.2.4. Векторные плазмиды и их доставка в клетки, используемые селективные маркеры
1.2.5. Способы сайт-направленной интеграции целевых генов в геном
1.2.6. Способы увеличения скорости пролиферации клеток и продолжительности их жизни
1.2.7. Способы воздействия на секрецию и фолдингрекомбинантных гликопротеинов
1.2.8. Оптимизация ростовых сред и способы культивирования штаммов-продуцентов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Эукариотические и бактериальные клетки
2.1.3. Вирусы и бактериофаги
2.1.4. Лабораторные животные
2.1.5. Комбинаторные фаговые библиотеки
2.1.6. Ферменты
2.1.7. Растворы
2.1.8. Культуральные среды
2.1.9. Плазмиды
2.1.10. Праймеры
2.2 МЕТОДЫ
2.2.1. Иммуноферментный анализ
2.2.2. Выделение суммарной РНК из гибридомных клеток
2.2.3. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
2.2.4. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.2.5. Определение нуклеотидных последовательностей
2.2.6. Электрофоретический анализ белков
2.2.7. Вестерн-блот анализ белков
2.2.8. Ферментативный гидролиз ДНК
2.2.9. Экстракция фрагментов ДНК из агарозного геля
2.2.10. Встраивание фрагментов ДНК в векторную плазмиду
2.2.11. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК
2.2.12. Электрофоретическое фракционирование ДНК
2.2.13. Амплификация фрагментов гена, кодирующего гликопротеин Е ВКЭ
2.2.14. Выделение плазмидной ДНК, не содержащей эндотоксинов
2.2.15. Адаптация клеток CHO K1 к суспензионному росту в бессывороточных средах
2.2.16. Трансфекция эукариотических клеток плазмидными ДНК
2.2.17. Очистка полноразмерных антител с использованием аффинной хроматографии
2.2.18. Получение штаммов-продуцентов полноразмерных антител в эукариотических клетках линии СНО-8
2.2.19. Оценка константы связывания антитела chFVN145 с белком Е ВКЭ
2.2.20. Исследование протективных свойств химерного антитела сНЕУЫ145 на мышиной модели КЭ
2.2.21. Статистический анализ
2.2.22. Амплификация пептидных библиотек
2.2.23. Аффинное обогащение пептидных библиотек
2.2.24. Выделение фаговых частиц, экспонирующих пептиды
2.2.25. Выделение ДНК бактериофагов, несущих пептид
2.2.26. Полимеразная цепная реакция с бляшек и определение нуклеотидной последовательности
2.2.27. 3Б-моделирование структуры гликопротеина Е ВКЭ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. СОЗДАНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ХИМЕРНОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА НА ОСНОВЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ
КЛЕТОК
3.1.1. Создание суспензионной линии CHO-S
3.1.2. Получение штамма-продуцента химерного антитела против ВКЭ с использованием плазмид pCLm4/hygro-FVN145 и pCHm2 -ЕУЫ145
3.1.3. Получение штаммов-продуцентов химерного антитела против ВКЭ с использованием бицистронной плазмиды pBudCE4.1 и ее производных
3.1.4. Создание суспензионной линии CHO-S/FRT
3.1.5. Конструирование кассетной плазмиды, кодирующей константные домены антитела человека, сайт гомологичной рекомбинации FRT и участки для быстрого клонирования генов, кодирующих целевые вариабельные домены антител
3.1.6. Конструирование плазмиды, несущей ген, который кодирует химерное антитело chFVN145, и локусы, обеспечивающие сайт-направленную рекомбинацию в геном
3.1.7. Создание штамма-продуцента химерного антитела chFVN145 с использованием гомологичной рекомбинации
3.1.8. Наработка и очистка химерного антитела против вируса клещевого энцефалита
3.2. ОЦЕНКА ИММУНОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНТИТЕЛА chFVN145 ПРОТИВ ВКЭ
3.2.1. Подготовка очищенного препарата антитела chFVN145; вестерн-блот анализ
3.2.2. Изучение аффинности антитела chFVN145
3.2.3. Изучение эпитопной специфичности химерного антитела против вируса клещевого энцефалита с использованием рекомбинантных фрагментов белка Е
3.2.4. Эпитопное картирование хАТ chFVN145 с использованием комбинаторных пептидных библиотек
3.3. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ АНТИТЕЛА chFVN145
3.3.1. Исследование способности антитела chFVN145 обеспечивать постконтактную профилактику ВКЭ у зараженных мышей
3.3.2. Исследование терапевтической эффективности антитела chFVN145 на мышиной модели
3.3.3. Подтверждение отсутствия опосредованного антителом chFVN145 усиления инфекции in vivo...................................Ошибка! Закладка не определена.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
113
114