Разработка ПЦР тест-системы для идентификации энтерогеморрагических E.COLI и дифференциации E.COLI О157:H7 Брюсова, Мария Борисовна

Краткое описание

Брюсова Мария Борисовна. Разработка ПЦР тест-системы для идентификации энтерогеморрагических E.COLI и дифференциации E.COLI О157:H7 : диссертация ... кандидата биологических наук : 16.00.03 / Брюсова Мария Борисовна; [Место защиты: Всерос. гос. центр качества и стандартизации лекарств. средств и кормов для животных].- Москва, 2009.- 109 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/371

Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1. ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ1.1. СИСТЕМАТИКА и КЛАССИФИКАЦИЯ1.2. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА ЭШЕРИХИЙ1.3. АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА ЭШЕРИХИЙ „2. ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ЭШЕРИХИЙ И ИХ РОЛЬ'В'* W « ^ *?,. „?, ,- ; ПАТОГЕНЕЗЕ2.1. КОЛОНИЗАЦИЯ КИШЕЧНИКА ЭГКП2.2. ШИГАПОДОБНЫЕ ВЕРОЦИТОТОКСИНЫ У " " " " ' ^ 6 - **" -2.2.1. НОМЕНКЛАТУРА ШИГАТОКСИНОВ ! . ! 16" '"•2.2.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШИГАТОКСИНОВ2.2.3. СТРОЕНИЕ ШИГАТОКСИНОВ и их ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ3. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ и эпизоотология ВОЗБУДИТЕЛЯ 2Х± .vJ4. ЭКОЛОГИЯ ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ЭШЕРИХИЙ К:.*. 27"' -" •5. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ЭШЕРИХИЙ6. ПРИНЦИП ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Введение к работе
Актуальность темы Впервые энтерогеморрагические кишечные палочки (ЭГКП) идентифицированы в 1982 г., когда штаммы Е. coli ранее неизвестного серотипа 0157:Н7, оказались причиной двух крупных вспышек гемморагического колита у детей в США (89, 97, 98, 118, 123).
Основным резервуаром энтерогеморрагических эшерихий (ЭГЭК) является крупный и мелкий рогатый скот (76, 81, 105, 128). Однако такие домашние животные, как свиньи, лошади, олени, птицы, собаки и кошки так же могут быть носителями ЭГКП (51, 108, 129). Выделяя бактерии с фекалиями во внешнюю среду, животные служат основным источником контаминации различных объектов ЭГКП. При проведениии мониторинга ЭГКП среди сельскохозяйственных животных в Европе, обнаружено, что в Германии около 20,8% животных и 2,6% исследованных проб мяса крупного рогатого скота (крс) были заражены Е. coli 0157:Н7. При исследовании образцов мяса в Финляндии, данный показатель составил1,4%, а в Бельгии -1,26% (89). При проведении мониторинга1 ЭГКП серовара 0157:Н7 в хозяйствах Рязанской, Воронежской, Тульской и Орловской областей обнаружено, что носительство среди крс составляет2,6%, среди свиней 0,9% и птиц - 0,8% (29, 30).
Вспышки инфекции у человека возникают при употреблении пищевых продуктов животного происхождения, контаминированных эшерихиями в процессе убоя, переработки, упаковки, хранения и приготовления пищи, а также фруктов и овощей, обсеменение которых происходит в результате контакта с фекалиями домашних и диких животных на какой-либо стадии их выращивания или обработки. По данным Центра Всемирной Организации Здравоохранения Животных (МЭБ), каждый год на территории США в среднем регистрируется до 72 000 случаев заболеваний людей, вызванных ЭГКП, из них около 60 летальных. В Великобритании в период 1995-2000 гг. зарегистрировано 18 вспышек геморрагического колита (ГК) у людей, заболеваемость за это время возросла с 6 до 411 случаев на 100 тыс. населения, а число смертельных исходов составило 2,5% (112, 129).
Наиболее распространенным и значимым для здравоохранения серологическим вариантом ЭГКП является серовар 0157:Н7, тем не менее, при спорадических случаях и эпизоотиях часто выявляются и другие серогруппы эшерихий: 026, 091, О103, О104, О П 1 , 0113, ОП7, 0118, 0121, 0128, 0145 (50, 97, 101, 105, 128), идентификация которых имеет немаловажное значение.
Сложность определения энтерогеморрагических эшерихий обусловлена тем, что среди множества непатогенных близкородственных представителей необходимо выявлять единичные серогруппы, которые приобретают измененные свойства в результате генетических мутаций, и не имеют фенотипических свойств, прочно коррелирующих с патогенностью (23, 89, 100,131,156).
Разработка новых высокочувствительных и специфичных экспресс методов для идентификации энтерогеморрагических Е. coli является актуальной задачей. В последние годы широкое распространение во многих странах получил метод выявления факторов патогенности ЭГКП с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР). Большинство молекулярногенетических методик, разработанных для идентификации ЭГКП, направлены на прямое выявление генов, кодирующих веротоксины (61, 74, 92, 103, 130, 154, 157). Метод ПЦР отличается высокой чувствительностью, специфичностью и универсальностью и позволяет выявлять ЭГКП не только в биологическом материале, но и в объектах внешней среды.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы являлась разработка тест-системы для идентификации энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации Е. coli 0157:Н7 методом ПЦР. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры для идентификации энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации серологического варианта 0157:Н7, разработать оптимальные параметры ПЦР и оценить эффективность различных способов выделения ДНК из патологического материала;2. Провести оценку аналитических и диагностических характеристик разработанной тест-системы;3. Сравнить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы с традиционным методом;4. Провести комиссионные испытания ПЦР-тест-системы для идентификации E.coli 0157:Н7 и дифференциации веротоксинов энтерогеморрагических E.coli методом ПЦР. Научная новизна Впервые сконструированы оригинальные праймеры для амплификации ДНК энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации E.coli 0157:Н7 в формате электрофоретической детекции.
Разработан положительный контрольный образец (ПКО) ДНК VT1, VT2, Н7, являющийся генно-инженерной конструкцией, несущей вставки фрагментов генов stxl, stx2 и fliCm Е. coli 0157:Н7. ПКО позволяет контролировать работу амплификационной смеси и является маркером длины ПЦР-продуктов.
Впервые в России разработана ПЦР тест-система для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических ?. coli, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 100 мк/мл.
Практическая значимость работы Впервые в России разработана и внедрена в ветеринарную практику тест-система «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР. Использование метода ПЦР в диагностических лабораториях позволит в течение одного рабочего дня проводить анализ биологического материала, продукции животного происхождения, объектов внешней среды на наличие ЭГКП, а также дифференцировать серологический вариант 0157:Н7, тогда как идентификация ЭГКП бактериологическим методом занимает от 6 до 7 суток и требует применения дополнительного исследования для определения веротоксинов.
С 2006 года на базе ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора аттестовано производство и налажен серийный выпуск тест-системы «КОЛИ-ДИФ» (Аттестат № 1167 от 01.02.06). Рекламаций на тест-систему в течение трех лет не поступало.
Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (2004-2007 гг.), а также на научных и практических конференциях:• Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», посвященной 75-летию ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006• 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2007» (Москва, 2007 г.);• Научно-проблемных методических комиссиях ФГУ «ВГНКИ» (2004-2007 гг.).
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 104 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003»), и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения.
Диссертация иллюстрирована И рисунками и 12 таблицами. Приложение к диссертации содержит разработанную нормативную документацию, подтверждающую результаты исследований, их научно-практическую ценность. Список литературы включает 162 источника, в том числе 127 иностранных.