Структурные исследования человеческого цистеинил-лейкотриенового рецептора второго типа для создания новых лекарственных препаратов Гусач Анастасия Юрьевна

Краткое описание

Гусач,АнастасияЮрьевна.Структурныеисследованиячеловеческогоцистеинил-лейкотриеновогорецепторавтороготипадлясозданияновыхлекарственныхпрепаратов: диссертация ... кандидата физико-математических наук : 03.01.02 /ГусачАнастасияЮрьевна; [Место защиты: ФГАОУ ВО «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»]. - Москва, 2020. - 178 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
Московский Физико-Технический Институт (Национальный Исследовательский Университет) На правах рукописиГусачАнастасияЮрьевнаСтруктурныеисследованиячеловеческогоцистеинил-лейкотриено- вогорецепторавтороготипадлясозданияновыхлекарственныхпрепаратовСпециальность: 03.01.02 Биофизика Диссертация

стр. 12
задачиисследованияПервоначальной и основной целью данной диссертационной работы было установление пространственной структуры высокого разрешениячеловеческогоцистеиниллейкотриеновогорецепторавтороготипа. Эта работа вместе с работой поисследованиюCysLT1рецептораявляется первым примером полногоструктурногоисследованияGPCRрецептораот клонирования и до анализа структуры как в нашей лаборатории, так и...

стр. 14
CysLT2рецептор. Положения, выносимые на защиту 1. Найдены генно-инженерные модификациичеловеческогоцистеиниллейкотриеновогорецепторавтороготипа, увеличивающие стабильность белка, уровень экспрессии и температуру денатурации. 2. Способ экспрессии рекомбинантногочеловеческогоцистеиниллейкотриеновогорецепторавтороготипа, обеспечивающий высокий выход гомогенного белка при его очистке. 3. Способ...

Оглавление диссертациикандидат наук Гусач Анастасия Юрьевна
Сокращения и аббревиатуры
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность нахождения структурной информации для человеческого CysLT2 рецептора для создания новых антагонистов
Основные цели и задачи исследования
Научная новизна
Теоретическая и практическая значимость
Положения, выносимые на защиту
Степень достоверности и апробация результатов
Объем и структура диссертации
1. ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Основные фазы создания нового лекарства:
1.2. Методы поиска новых лекарств:
1.2.1. Фенотипический подход и подход с использованием конкретного белка-мишени
1.2.2. Полифармакология и комбинированные подходы
1.3. Рациональная разработка лекарств c использованием белка-мишени (target-based): начальные этапы
1.3.1. Выбор биологической мишени и ее валидация:
1.3.2. Скрининг кандидатов в лекарства и выбор хитов:
1.3.3. Выбор хитов
1.3.4. Улучшение хитов и выбор лидирующих соединений (стадия hit-to-lead)
1.3.5. Оптимизация лидирующих соединений (lead optimization)
1.4. Роль структурной биологии в создании лекарств
1.5. Рентгеновская кристаллография в создании лекарств:
1.6. Серийная рентгеновская кристаллография и использование лазеров на свободных электронах (XFEL) для сложных мишеней драг-дизайна
1.7. Рецепторы, сопряженные с G-белком как мишени лекарств
1.7.1. Введение
1.7.2. Активация клеточного ответа
1.7.3. Модуляция активности GPCR и классификация лигандов
1.7.4. Терапевтическая важность
1.8. Получение структур GPCR методом рентгеновской кристаллографии и их использование в процессе рационального поиска лекарств
1.8.1. Другие методы структурных исследований рецепторов, сопряженных с G-
белком
1.9. СуБЬТ2 рецептор класса ОРСЯ как мишень лекарств
1.9.1. Лейкотриены
1.9.2. Лейкотриеновые рецепторы
1.9.3. Характеризация человеческого СувЬТ2 рецептора
1.9.4. Экспрессия СуБЬТ2Я в организме
1.9.5. Сигнальные каскады СуБЬТ2 рецептора
1.9.6. Полиморфизмы и мутации СуБЬТ2 рецептора и их роль в патологиях
1.9.7. Опосредованное взаимодействие с другими рецепторами
1.9.8. Роль цистеиниловых лейкотриенов и СуБЬТ2 рецептора в развитии заболеваний
1.10. Поиск лигандов цистеинил лейкотриеновых рецепторов без информации об их структуре: антиастматические препараты
1.10.1. Медленно-реагирующая субстанция анафилаксии как средство скрининга
1.10.2. Постановка экспериментов с синтетическими лейкотриенами и единичными рецепторами
1.10.3. Общие подходы к разработке первых антагонистов действия цистеиниловых лейкотриенов
1.10.4. Создание антагонистов цистеинил лейкотриеновых рецепторов зафирлукаста, монтелукаста и пранлукаста
1.10.5. Создание двойных СуБЬТ1/СуБЬТ2 лигандов
2. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Создание праймеров
2.2.2. Полимеразная цепная реакция
2.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
2.2.4. Выделение и очистка ДНК из агарозного геля
2.2.5. Определение концентрации ДНК или белка в растворе, оптической плотности клеток на длине волны 600 nm с помощью спектрофотометра IMPLEN
2.2.6. Выделение плазмидной ДНК клеток Exoli
2.2.7. Рестрикция
2.2.8. Рестрикция DpnI
2.2.9. Лигирование
2.2.10. Секвенирование ДНК
2.2.11. Трансформация
2.2.12. Выделение бакмиды
2.2.13. Трансфекция клеток насекомых Sf9
2.2.14. Культивирование клеток Sf9
2.2.15. Определение процентной доли живых клеток Sf9 и их концентрации
2.2.16. Определение жизнеспособности клеток Sf9
2.2.17. Определение заражающего титра вируса
2.2.18. Характеризация вируса определением процента GP64-положительных клеток
2.2.19. Инфицирование Sf9 вирусом и наработка белка и вируса
2.2.20. Определение уровня поверхностной экспрессии белка в клетках Spodoptera frugiperda Sf9 методом проточной цитометрии
2.2.21. Солюбилизация белка GPCR
2.2.22. Очистка белка
2.2.23. Денатурирующий электрофорез белков в ДСН-ПААГ
2.2.24. Вестерн-Блоттинг и дот-блоттинг
2.2.25. Анализ термостабильности белка методом дифференциальной сканирующей флуориметрии
2.2.26. Анализ монодисперсности белка методом гель-фильтрации
2.2.27. Кристаллизация белка в липидной кубической фазе
2.2.28. Исследования диффузии белка в липидной кубической фазе методом FRAP
2.2.29. Извлечение кристаллов из липидной кубической фазы
2.2.30. Измерения дифракции кристаллов методом рентгеновской дифракции
2.2.31. Обработка данных дифракции
2.2.32. Функциональные тесты в клетках млекопитающих HEK293
2.2.33. Определение поверхностной экспрессии в клетках млекопитающих HEK293 методом ELISA
3. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Дизайн первого раунда конструкций
3.2. Выбор системы экспрессии
3.3. Создание первого раунда генно-инженерных конструкций
3.4. Подбор условий экспрессии рецептора в клетках насекомых Sf9
3.5. Подбор условий солюбилизации и очистки белка
3.6. Сравнительный анализ первичных конструкций
3.7. Создание и скрининг конструкций с различными партнерными белками
3.8. Экспрессия и очистка конструкций с точечными мутациями
3.9. Оптимизация экспрессии конструкций с точечными мутациями
3.10. Комбинирование точечных мутаций (по 2, 3 и 4)
3.11. Сравнительный анализ стабильности белка в присутствии различных лигандов
3.12. Анализ диффузии в липидной кубической фазе конструкций, полученных в 3 раунде оптимизации
3.13. Повышение выхода белка за счет варьирования длины N-конца
3.14. Кристаллизация рецептора в комплексе с лигандом L в липидной кубической фазе
3.15. Оптимизация кристаллов
3.16. Кристаллизация рецептора в комплексе с лигандами O и S
3.17. Получение данных дифракции и уточнение структур
3.18. Общие свойства структуры CysLT2 рецептора в комплексе с антагонистами:
3.19. Создание мутантов для функциональных тестов в клетках млекопитающих
3.20. Анализ положения аминокислот, находящихся в консервативных позициях и сравнение CysLT1R и CysLT2R
3.21. Анализ лиганд-связывающего кармана
3.22. Анализ селективности рецепторов CysLT1R и CysLT2R к различных синтетическим антагонистам
3.23. Структурный анализ встречающихся в природе полиморфизмов CysLT2 рецептора и мутаций, приводящих к различным заболеваниям
ГЛАВА 4. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ
ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ