Влияние рекомбинантной двухкассетной плазмидной конструкции, несущей гены vegf165а и bmp2, на процессы остеогенеза in vitro и in vivo Журавлева Маргарита Николаевна

Краткое описание

Журавлева,МаргаритаНиколаевна.Влияниерекомбинантнойдвухкассетнойплазмиднойконструкции,несущейгеныvegf165аиbmp2,напроцессыостеогенезаinvitroиinvivo: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.03.04 /ЖуравлеваМаргаритаНиколаевна; [Место защиты: Казанский (Приволжский) федеральный университет]. - Казань, 2019. - 179 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
рукописиЖуравлеваМаргаритаНиколаевнаВЛИЯНИЕРЕКОМБИНАНТНОЙДВУХКАССЕТНОЙПЛАЗМИДНОЙКОНСТРУКЦИИ,НЕСУЩЕЙГЕНЫVEGF165А ИBMP2, НАПРОЦЕССЫОСТЕОГЕНЕЗАINVITROИ INVIVO03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:

стр. 11
оценка индукции репаративногоостеогенезапри применении кодон-оптимизированнойплазмиднойгенетическойконструкции,несущейкДНКгеновvegf165a иbmp2в составе матриксов, совмещенных с ДНК. 12 В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: 1. Разработать экспрессионныеплазмидныеконструкции, кодирующие комбинации кДНКгеновvegf165A иbmp2, а именно pBud-Kan-VEGF165ABMP2, pBud-Kan-VEGF165A-eGFP,...

Оглавление диссертациикандидат наук Журавлева Маргарита Николаевна
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Современные представления об эмбриональном и репаративном остеогистогенезе
1.2 Понятие индуцированного остеогистогенеза
1.3 Генная индукция регенерации костной ткани. Выбор целевых генов29
1.3.1 Костные морфогенетические белки
1.3.2 Клиническое применение и доклинические исследования BMP2
1.3.3 Сосудистый эндотелиальный фактор роста
1.3.4 Доклинические исследования и клиническое применение VEGF для стимуляции остеорегенерации
1.3.5 Комбинированное применение VEGF и BMP2
1.4 Выбор вектора для создания генно-терапевтического препарата
1.4.1 Использование двухкассетных плазмидных векторов
1.4.2 Особенности переноса плДНК в клетки-мишени in vitro и in vivo
1.4.3 Проблема целевой доставки плазмидной ДНК
1.5 Концепция матриксов, совмещенных с ДНК, и проблема выбора материала-носителя
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Методы работы с плазмидными генетическими конструкциями
2.1.1. Создание плазмидных генетических конструкций
2.1.2 Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами
2.1.4 Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом секвенирования
2.1.5 Трансформация E.coli разработанными генетическими конструкциями
2.1.6 Выделение плазмидной ДНК из E. Coli
2.1.7 Электрофоретический анализ плДНК
2.2 Методы работы с культурами эукариотических клеток
2.2.1 Выделение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из костного мозга человека
2.2.2 Выделение мультипотентных стромальных клеток из костного мозга крысы
2.2.3 Выделение остеобластов черепа крыс
2.2.4 Проточная цитофлуориметрия
2.3 Методы трансфекции эукариотических клеток
2.3.1 Трансфекция клеток HEK293FT, ММСК-КМ человека, крысы, остеобластов крысы
2.4 Методы определения синтеза белков BMP2 и VEGF165A
2.4.1 Флуоресцентная иммуноцитохимия
2.4.2 Иммуноблоттинг
2.4.3 Иммуноферментный анализ
2.5 Методы оценки остеогенной дифференцировки ММСК и остеобластов
2.5.1 Остеогенная дифференцировка ММСК и остеобластов крысы
2.5.2. Выявление кальциевых депозитов реакцией von Kossa
2.5.3 Выявление кальциевых депозитов окрашиванием ализариновым красным
2.5.4 Определение активности щелочной фосфатазы
2.6 Формирование клетками капилляроподобных структур на внеклеточном матриксе Matrigel
2.7 Создание остеопластического материала, совмещенного с ДНК
2.7.1 Совмещение остеопластических материалов с плазмидной ДНК pBudKan-coVEGF165А-coBMP2 и определение емкости материалов для плазмидной ДНК
2.7.2 Определение метаболической активности клеток при воздействии смывов с остеопластических материалов и остеопластических материалов, совмещенных с pBudKan-coVEGF165A-coBMP2 (MTS-тест)
2.8 Эксперименты in vivo
2.8.1 Гетеротопическая (внутримышечная) имплантация остеопластических материалов
2.8.2 Оценка влияния остеопластических материалов, совмещенных с ДНК, на процессы регенерации костной ткани
2.8.3 Оценка эффективности трансфекции клеток реципиентного ложа методом ПЦР-РВ
2.8.4 Подготовка образцов тканей для гистохимического и иммуногистохимического исследования
2.9 Гистохимическое исследование
2.10 Иммуногистохимическое исследование
2.9.1 Морфометрическая оценка результатов гистохимического и иммуногистохимического исследования
2.10 Статистическая обработка результатов и программное обеспечение
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Создание генетических конструкций
3.2 Получение и анализ первичных культур эукариотических клеток
3.3 Анализ синтеза рекомбинантных белков VEGF165A и BMP2 клетками HEK 293 FT, ММСК костного мозга крысы, человека, остеобластами крысы, трансфицированными плДНК pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2
3.5 Анализ остеогенной дифференцировки ММСК костного мозга и остеобластов крысы под влиянием среды, кондиционированной клетками HEK293FT, трансфицированными pBud-Kan-coVEGF165A-coBMP2
3.5.1 Выявление минеральных отложений in vitro
3.5.2 Определение активности щелочной фосфатазы
3.7 Создание остеопластических материалов, совмещенных с ДНК
3.7.1 Определение плДНК-связывающей способности остеопластических материалов
3.7.2 Определение цитотоксичности остеопластических материалов и матриксов, совмещенных с pBudKan-coVEGF165A-coBMP2 (MTS-тест)
3.7.3 Оценка экспрессии кодон-оптимизированных генов vegf165a и bmp2 в
3.8 Гетеротопическая (внутримышечная) имплантация остеопластических
3.9 Оценка влияния остеопластических материалов, совмещенных с ДНК, на процессы регенерации костной ткани (ортотопическая имплантация)
107
клетках гетеро- и ортотопического ложа
108
материалов
111
113
ГЛАВА 4.ОБСУЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
129
148
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
150
152
ВВЕДЕНИЕ