МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЛИМФОИДНЫХ СТРУКТУР РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛОВ ТОЛСТОЙ КИШКИ ЧЕЛОВЕКА В ОНТОГЕНЕЗЕ : МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ОСОБЛИВОСТІ ЛІМФОЇДНИХ СТРУКТУР РІЗНИХ ВІДДІЛІВ ТОВСТОЇ КИШКИ ЛЮДИНИ В ОНТОГЕНЕЗІ

Короткий зміст

Матеріали і методи дослідження. Виходячи з поставлених завдань, за об'єкти дослідження взяті відділи товстої кишки людини в різні вікові періоди. В кожному випадку досліджувалися висхідний відділ ободової кишки, поперечно - ободова кишка, низхідний відділ ободової кишки і сигмоподібна кишка.

Всього досліджено 149 об'єктів: людей, померлих від причин, не пов'язаних із захворюваннями органів травлення та імунної системи і за даними протоколів розтину не мають уражень з боку травного тракту та імунної системи. Матеріал від ембріонів, плодів і новонароджених отримували з патологоанатомічного відділення при 5-ій багатопрофільній дитячій лікарні, а дітей, дорослих і людей літнього і старечого віку з моргу судово-медичної експертизи м. Запоріжжя.

Дослідження здійснювалися відповідно до принципів Гельсінської декларації, прийнятою Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (2000), Конвенції Ради Європи про права людини й біомедицини (1997), що відповідають положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних наукових суспільств, Міжнародного кодексу медичної етики (1983), затвердженими I Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001).

Для визначення віку об'єктів використовували дані історії хвороби або пологів, протоколи розтину. Вік ембріонів і плодів визначали виміром крижово-тім'яних розмірів за А. Шульцем (1926). В основу класифікації покладені рекомендації, прийняті конференцією з вікової морфології, фізіології і біохімії (Москва, 1965), на IX міжнародному конгресі геронтологів (Київ, 1972), а також схем вікової періодизації А.Р. Кнорре (1959), Л.К. Семенової (1969),               В.Я. Лумпельського (1978) і рекомендації експертів ВООЗ.

Всього ембріонів і плодів - 44, людей різного віку - 105.

Для дослідження кусочки товстої кишки фіксувалися в 10%  нейтральному формаліні. Після фіксації матеріал зневоднювали у батареї спиртів висхідної концентрації починаючи з 40% і закінчуючи абсолютним спиртом. Як проміжна речовина використовувався хлороформ. Кусочки досліджуваного матеріалу заливали в суміш парафін-каучук-віск у співвідношенні 20:1:1 відповідно. З парафінових блоків виготовлялися серійні зрізи товщиною 3 - 5 мкм по загальноприйнятій методиці Е. Пірса (1962). Парафінові зрізи забарвлювали гематоксиліном Карацці та Ерліха, еозином, по методу Ван - Гізон, альціановим синім та еозином, реактивом Шиффа та аналізували з урахуванням індивідуальної мінливості ознаки в межах організму (Г.С. Катінас,                     І.Р.  Потапова зі співавт., 1983).

Для ідентифікації морфофункціонального стану популяції лімфоїдних клітин використовувався метод лектиногістохімії. З цією метою використовувалися лектин арахісу (PNA), який специфічно зв'язується із залишками  D- галактози та лектин сої (SBA), який специфічний до залишків N-ацетил-cD-галактозаміна. Лімфоцити з мембранними рецепторами до лектину арахісу відносяться до Т-клітинної популяції лімфоцитів різної міри диференціації, відповідно це не зрілі форми (Л.І. Іванюта, 1996; Я.М. Кабак, 1968). Також наявність PNA- рецепторів характерна і для лімфобластів гермінативних центрів лімфоїдних вузликів. Лімфоцити з рецепторами до лектину сої є В-лімфоцитами, які не завершили процеси диференціації в центральних органах імунної системи (Л.І. Іванюта, 1996; Я.М. Кабак, 1968).

Зрізи обробляли розчином кон’югата лектину з пероксидазою хріну (лектин-HRP) на протязі 8 годин при кімнатній температурі в темноті, заздалегідь інактивувавши ендогенну пероксидазу шляхом обробки зрізів протеазами на протязі 10 хв. при температурі +37°С і проведенням кислотного гідролізу згідно Quintarelli et al. (1961) для відщеплення сіалових кислот. Контрольні зрізи інкубували з кон’югатом лектин-HRP у присутності 0,4% розчину відповідного моносахариду.

Лектини виготовлені в лабораторії “Лектінотест” з сировини Карпатського регіону (м. Львів).

Імуногістохімічний метод дозволяє ідентифікувати антигенні детермінанти клітин і тканин на підставі специфічної взаємодії антигена і антитіла, що визначається на світлооптичному або ультраструктурному рівнях.

Дана методика заснована на з'єднанні строго специфічного моноклонального антитіла з антигенними детерминантами.

Висока спорідненість авідину (відносно крупного протеїну, що отримується з яєчного білка) до біотину, що є вітаміном з низькою молекулярною  вагою, дозволяє досягти дуже високої тропності, більш високої, ніж константи спорідненості найсильніших реакцій антиген-антитіло.

Авідин має чотири ділянки зв’язування і є своєрідним молекулярним клеєм, який об'єднує 2 різних компонента (пероксидазу і вторинне антитіло, яке з'єднується з авідином внаслідок того, що обидва біотинильовані).

Даний фермент, виділений з кореня хріну, розщеплює перекис водню. Активність ендогенної пероксидази блокується специфічною сироваткою, яка входить до складу системи візуалізації. Метод визначення активності пероксидази заснований на забарвленні хромогена, виступаючого у ролі донора електронів, у присутності перекису водню.

У якості хромогену ми використовували DAB-3-діамінобензидину тетрахлорид (продукт реакції коричневого кольору, нерозчинний в органічних барвниках, проте вимагає обережного відношення, оскільки є канцерогеном).

Зрізи товщиною 4-5 мкм наносилися на предметне скло, спочатку оброблене адгезивною рідиною (poly-L-lysіne), потім, депарафінізувалися відповідно до прийнятих стандартів.

Фіксація матеріалу має особливе значення для імуногістохімії - при фіксації кислим формаліном спостерігається стійке сполучення антигенних детерминант.  Нівелювати цей дефект можливо, використовуючи фіксацію в забуференому формаліні з подальшим проведенням теплової індукції епітопного (антигенного) повернення (HІER - heat іnductіon of epіtope retrіeval).

Ми використовували нагрівання на водяній бані в цитратному буфері з рН=6,0 (впродовж 30 хвилин після досягнення температури  98⁰С) та автоклавуванням (5 хвилин при температурі +121⁰С) з симетричним розташуванням стекол в кюветі.

Як первинні антитіла використовували антитіла фірми DAKO до CD3 (клон РС3/188А), CD20 (клон L26), CD34 (клон QBEnd 10), панцитокератинів (клона АЕ1/АЕ3).

CD3, CD20 детермінанти локалізуються на мембрані лімфоцитів, фракції розцінювалися напівкількісним методом, при якому оцінювалися інтенсивність реакцій та забарвлення клітинних мембран (+ - розцінювалося як слабо виражена). CD34  локалізувалися на поверхні ендотеліоцитів, панцитокератини - в епітелії. Для кожного маркера ми проводили контрольні дослідження з метою виключення хибнопозитивного або хибнонегативного результату. Як розчинник антитіл ми використовували фірмовий розчинник ANTІBODY  DІLUENT (DAKO).

Подальшу обробку проводили за допомогою системи візуалізації LSAB2 (DAKO) протягом 10 хвилин з кожним реактивом (з біотинилізованими антитілами і стрептавідин-пероксидазним комплексом).

Потім ми проводили реакцію з хромогеном (DAB (DAKO)), оцінюючи якість взаємодії під контролем мікроскопа на протязі від 20 секунд до 3 хвилин.

Для адекватного уявлення про структури тканини зрізи додатково забарвлювалися гематоксиліном Майєра протягом 3 хвилин. Дегідратація і заключення в бальзам здійснювалися відповідно до загальновідомих методик.

Результат розцінювали як позитивний при випаданні солей хромогену у вигляді специфічної реакції (цитоплазматична, мембранна або ядерна реакція залежно від локалізації антигену).

З метою контролю методу була проведена серія досліджень з використанням позитивних і негативних зразків, які служили еталонами.

Кількість розподілу вузликів визначали на тотальних препаратах слизової оболонки товстої кишки, забарвлених за методом В.К. Сирцова (1981), авторське свідоцтво № 964522. З цією метою підраховували кількість лімфоїдних утворень на площі 1 см² в зразках висхідного відділу ободової кишки, поперечно-ободової кишки, низхідного відділу ободової кишки і сигмоподібної кишки людей різного віку.

Окрім цього вивчалася форма вузликів, розміри й площа. Розміри вузликів визначали окуляр-мікрометром. Площу обчислювали за формулою S= π/4*(a*b), де S - абсолютна площа лімфоїдних вузликів в мкм², π = 3,14; а і b - найменший і найбільший діаметри лімфоїдних утворень (Г.Г. Автанділов, 1990;                   М.В. Головизнін, 1993; В.М. Запорожан, В.К. Напханюк, 2000).

Для ідентифікації клітин в лімфоїдних утвореннях використовували вказівки (В.П. Бикова, О.П. Терезина, 1995; Д.Б. Никитюк,1998).  

За малі лімфоцити бралися клітини з діаметром ядра 2,8- 4,2 мкм, інтенсивно забарвленим, округлої або бобоподібної форми, хроматин ядра компактний, або глибчастої структури з невеликими проясненнями, в ньому є одне крупне ядерце, ексцентрично розташоване, слабо помітне на тлі конденсованого хроматину. Навколо ядра вузький обідок цитоплазми.

У середніх лімфоцитів ядро діаметром 4,2-5,6 мкм, з хроматином менш щільним у вигляді скупчень по периферії, з 1-2 ядерцями; форма ядра частіше овоїдна. Обідок цитоплазми ширший, досягає 7-9 мкм в діаметрі.

Великі лімфоцити (лімфобласти) - 12- 15 мкм - мають ядро круглої форми. Хроматин розподіляється рихло і нерівномірно. Виявляється одне крупне ядерце, рідше кількість ядерець може досягати двох-трьох. Цитоплазма слабко базофільна, виражена перинуклеарна зона.

Плазмобластом і проплазмоцитом, через нечіткі морфологічні відмінності, вважали клітину розміром 16-25 мкм в діаметрі, з ядром, розташованим або центрально, або ексцентрично, яке займає більшу частину клітини і яке має ніжну структуру хроматину і ядерця. У цитоплазмі визначалася перинуклеарна зона прояснення.

До плазмоцитів відносили клітини округлої або овальної форми, розміром від 7 до 10 мкм, з ядром круглої або овальної форми, розташованим ексцентрично. Цитоплазма плазмоцита різко базофільна з вираженою перинуклеарною зоною. У ядрі спостерігається конденсований хроматин, розташований ексцентрично.

До макрофагів відносили великі від 20 до 40 мкм в діаметрі клітини, різної форми з нерівною цитолемою, бобоподібним або неправильної форми ядром, хроматин якого має сітчасто-петлясту структуру і в, йому помітне 1-2 ядерця, центрально або злегка ексцентрично розташоване.

Ретикулярні клітини відрізнялися непостійною формою. Вони мали слабкобазофільну цитоплазму неправильної форми, з одним або декількома відростками, ядра бідні хроматином, який розташовується у вигляді глибок. Клітини тісно контактують з тонким колагеновими волокнами.

Ознаками дегенерації клітин є наявність в цитоплазмі вакуолізації, в ядрах глибки хроматину, локалізовані на ядерній оболонці. У ядрах часто виявляються явища пікнозу і кариорексиса. Цитоплазма клітин не чітка і слабко забарвлюється барвниками.

З метою аналізу шляхів термінального кровотоку у всіх відділах товстої кишки людей різного віку вивчалося мікроциркуляторне русло.

Кровоносні судини мікроциркуляторного русла класифікувалися на артеріоли, капіляри і венули.

За артеріоли приймали судини діаметром 10-40 мкм, що мають в середній оболонці більше, ніж один шар гладком'язових клітин, добре розвинену внутрішню еластичну мембрану. Адвентиція артеріол представлена тонкими колагеновими і окремими еластичними волокнами.

Капілярами вважали дрібні кровоносні судини діаметром 4-10 мкм, стінка яких складається з ендотелію, базальної мембрани і адвентиціальних клітин та перицитів.

До венул відносилися кровоносні судини діаметром 20-50 мкм, внутрішній шар яких утворений високими ендотеліальними клітинами. Між ними та гладком'язовими клітинами середньої оболонки була нечітко виражена тонка мембрана. Гладком'язові клітини у венулах представлені частіше одним шаром.

Функціональний стан артеріол діагностували по розташуванню гладком'язових клітин. У звужених закритих судинах гладком'язові клітини лежать криво, подовжньо або радіально.

Клітинний склад лімфоїдного вузлика досліджували за допомогою морфометричної сітки по методу С.Б. Стефанова (1988) в абсолютних і відносних величинах.

В кожному випадку з серії зрізів на кожному десятому зрізі підраховували мітотичний індекс (МІ) для кожної зони лімфоїдного утворення.

Кількісні дані оброблені статистичним методом, запропонованим              С.Б. Стефановим (1985) з використанням таблиць Р.Б. Стрелкова (1980) для обчислення 95% довірчого інтервалу з врахуванням індивідуальної мінливості ознаки в межах організму. Середні величини порівнювали з показниками критерію Фішера-Стьюдента. Розбіжності середніх величин вважали достовірними при р<0,05.

Для обчислення вихідних параметрів та коефіцієнтів, для  статистичного аналізу використовувалася ліцензована програма StatSoft Statistica v6.0 Multilingual (serial 31415926535897).

Фотодокументація вироблялася за допомогою світлового мікроскопа PZO “Poland” і цифрового фотоапарата “Olympus” FE-130.

Результати дослідження та їх обговорення. Морфофункціональна характеристика структурних елементів товстої кишки людини в різні періоди пренатального онтогенезу. У ембріонів 8 тижневого віку в закладці товстої кишки починається диференціювання клітин покривного епітелію, клітин фібробластичного ряду, ретикулярних і гладком'язових клітин.

Диференціювання покривного епітелію продовжується на 9-10 тижні внутрішньоутробного розвитку. У цей період формуються відділи товстої кишки. Покривний епітелій утворює ворсинки і крипти, що містять келихоподібні клітини. У цей період власна пластинка рихлої сполучної тканини і підслизової основи представлена малодиференційованими клітинами фібробластичного ряду рихлої сполучної тканини, тонкими колагеновими та еластичними волокнами. На підставі проведених досліджень вперше виявлено, що на 7-8 тижні внутрішньоутробного періоду в закладці товстої кишки з'являються судини гемомікроциркуляторного і лімфатичного русла.

На 9-10 тижні диференціювання клітинних елементів тканини стінки кровоносних і лімфатичних судин приводить до утворення лімфоїдних скупчень.

На 12-14 тижні формуються відділи товстої кишки. У цих відділах диференціюються кінцеві форми покривного епітелію, що супроводжується збільшенням вмісту келихоподібних клітин в епітелії. У лімфоїдних утвореннях всіх відділів товстої кишки субепітеліальна зона характеризується достовірно більшим вмістом малих і середніх лімфоцитів у плодів чоловічої статі, чим у жіночої статі. У цій зоні виявляються одиничні макрофаги, лімфобласти, дегенеративні клітини. Біля макрофагів локалізуються зрілі плазматичні клітини.

До кінця 5-го початку 6-го місяців в слизовій  оболонці та в підслизистій основі виявляються лімфоїдні вузлики, з тендітною капсулою. Їх розмір до 9 місяця збільшується від 0,3±0,01 мм до 0,6±0,01 мм. У субепітеліальній зоні ЛЕВ спостерігається тенденція до міграції CD3+ лімфоцитів у епітелій. Цитоархітектоника ЛЕВ представлена в основному малими лімфоцитами (78,3%±0,03), середніми лімфоцитами  (12,2%±0,03), ретикулярними клітинами (3,8%±0,03), лімфобластами (1,5%±0,03), макрофагами (1,4%±0,03), клітинами з фігурами мітозу (1,8%±0,03), плазматичними клітинами (1,0%±0,03). Навколо макрофагів виявлялися скупчення малих лімфоцитів у вигляді «розеток». У цій зоні макрофаги набувають відросчатої форми. Клітини строми лімфоїдних утворень за структурою нагадують фібробласти волокнистої сполучної тканини з овальними або витягнутими ядрами, рівномірно розподіленими глибками хроматину і невеликими ядерцями. Вміст ретикулярних клітин порівняно з попереднім віком достовірно не змінюється.

Периферична зона розширюється за рахунок малих і середніх лімфоцитів, CD3+ лімфоцитів вміст яких порівняно з початковими етапами онтогенезу достовірно відрізняється в плодів чоловічої і жіночої статі. У периферичній зоні лімфоїдних утворень виявляються одиничні макрофаги і плазматичні клітини. Достовірно (р<0,05) збільшується кількість дегенеративних    клітин    в    плодів    обох статей. Ці клітини в основному овальної форми, з нечітко контурованою плазмолемою, фрагментованим ядром з нерівною, оксифільною цитоплазмою. Центральна зона ПВЛВ висхідного відділу товстої кишки характеризується достовірно (р<0,03) меншим вмістом малих і середніх лімфоцитів та більшим вмістом CD20+ лімфоцитів порівняно з периферичною зоною у плодів обох статей. Кількість PNA+ лімфоцитів переважала над вмістом SBA + лімфоцитів та була представлена як 7:1 відповідно. Капілярна мережа в цій зоні більш виражена (у 2 рази) порівняно з попередніми віковими групами. Наявна позитивна реакція CD34 на плазмолемі ендотеліоцитів.

Виявлені лімфобласти на різних стадіях мітозу (МІ - 1,5±0,03). Одиничні зрілі плазматичні клітини локалізуються в гермінативному центрі серед лімфоцитів. У низхідному відділі і сигмоподібній кишці функціональна активність лімфоцитів збільшується порівняно з плодами 7-8 місяців. Достовірно більше виявляється Т- лімфоцитів (CD3+ лімфоцитів).

Період новонародженості і ранній дитячий вік (від 0 до 11 років). В період новонародженості морфофункціональні зміни в товстій кишці характеризувалися наступними ознаками: яскравою позитивною мембранною реакцією епітеліоцитів з панцитокератинами, збільшенням кількості келихоподібних клітин, посиленням їх секреторної активності,  збільшенням інфільтрації CD3+ лімфоцитами епітелію слизової оболонки у всіх відділах товстої кишки. У висхідному відділі товстої кишки кількість лімфоїдних утворень зросла у 1,4 рази, в сигмоподібній кишці вміст лімфоїдних утворень залишався тим самим. Порівняно з плодами 9-ти місяців структурна організація гемомікроциркуляторного русла не зазнавала істотних змін. Експресія маркеру CD34 різко позитивна.

У грудному віці в ЛЕВ та ПВЛВ спостерігалося розростання капілярного мікроциркуляторного русла, калібр артеріол збільшився в 1,5 рази.

У цей період постнатального онтогенезу в лімфоїдних утвореннях товстої кишки вперше виявлені зміни у клітинному складі як у чоловіків, так і у жінок (мал.1).